本发明专利技术公开了一种毕赤酵母壁蛋白及其构建的表面展示系统和构建方法。所述巴斯德毕赤酵母壁蛋白的氨基酸序列为SEQNO：1；所述巴斯德毕赤酵母细胞表面展示系统是以所述的巴斯德毕赤酵母壁蛋白Gcw51为锚定蛋白，将靶蛋白固定在巴斯德毕赤酵母细胞表面构成的。本发明专利技术的壁蛋白Gcw51在毕赤酵母中表达量十分高，与现已用于巴斯德毕赤酵母表面展示系统的内源锚定蛋白Pir1蛋白和Pir2蛋白相比，分别高9倍和21倍。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种巴斯德毕赤酵母壁蛋白Gcw51及其构建的表面展示系统和构建方法。
技术介绍
目前在微生物表面展示系统中应用比较多的宿主菌主要有噬菌体、 细菌(如大肠杆菌Escherichia, coli、奇异变形菌teus mirabilis等)、酿酒酵母 {Saccharomyces ce/^Fisiae)禾口巴其Jf德毕赤酵母(/7ZcAia pastoris)0 表面展示使用的锚定蛋白一般具有以下特征(1)较牢固地锚定在细胞表面，不会轻易地从细胞表面脱落；可以与靶蛋白序列有效融合而不影响靶蛋白的结构和功能；(3)对蛋白酶有一定的抗性。细菌表面展示系统的锚定蛋白主要有细菌菌毛蛋白、S层蛋白、冰核蛋白(INP)和一些外膜蛋白。酿酒酵母表面展示系统的锚定蛋白主要有凝集素系统、絮凝素系统和其它GPI 锚定(glycosylphosphatidylinositol anchored)蛋白系统和一些Pir蛋白系统。巴斯德毕赤酵母具有可以实现高密度发酵(细胞密度可高达140g/L)、蛋白适度糖基化和发酵培养基组成简单等优点，在微生物细胞表面展示方面的应用具有非常广阔的前景，目前已有许多种蛋白，如解脂耶氏酵母脂肪酶、乳酸克鲁维酵母黄酶、米根霉脂肪酶等已经成功地展示在巴斯德毕赤酵母表面。目前巴斯德毕赤酵母表面展示系统中使用的锚定蛋白主要来自酿酒酵母的凝集素系统、絮凝素系统和kdlp蛋白等。但是，这些锚定蛋白不是毕赤酵母的组成成分，而是通过人为手段外源引进的。因此用外源壁蛋白作为毕赤酵母表面展示系统的锚定蛋白，可能会与内源壁蛋白竞争壁蛋白结合位点，导致展示效率不高。Khasa YP (Khasa YP, et al. Isolation of Pichia pastoris PIR genes and their utilization for cell surface display and recombinant protein secretion. Yeast. 2010. (published online).)等报道了利用毕赤酵母Pir蛋白作为锚定蛋白进行外源蛋白的细胞表面展示。但专利技术人发现Pir蛋白本身的表达量较低，作为毕赤酵母表面展示系统的锚定蛋白效果一般。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提高用于巴斯德毕赤酵母表面展示系统的内源锚定蛋白的表达效率。本专利技术解决上述问题的技术方案是一种巴斯德毕赤酵母壁蛋白Gcw51，该蛋白的氨基酸序列为SEQ NO :1。本专利技术所述的巴斯德毕赤酵母壁蛋白由194个氨基酸组成，大小约为19.8KDa。 本专利技术所述的巴斯德毕赤酵母壁蛋白以共价键的形式结合在巴斯德毕赤酵母细胞壁上，用十二烷基硫酸钠法不能提取，可以用β -1，3-葡聚糖酶法提取。本专利技术所述的巴斯德毕赤酵母壁蛋白Gcw51可用于构建毕赤酵母细胞表面展示系统，所述的巴斯德毕赤酵母细胞表面展示系统是以所述壁蛋白为锚定蛋白将靶蛋白固定在毕赤酵母细胞表面构成的。编码所述巴斯德毕赤酵母壁蛋白GCW51的基因，核苷酸序列如SEQ NO 4所示。一种巴斯德毕赤酵母细胞表面展示系统，是以所述的巴斯德毕赤酵母壁蛋白 Gcw51为锚定蛋白，将靶蛋白固定在巴斯德毕赤酵母细胞表面构成的。上述巴斯德毕赤酵母细胞表面展示系统可通过以下步骤构建(1)将权利要求2所述的基因克隆到表达载体的表达盒中，得到以权利要求1所述巴斯德毕赤酵母壁蛋白为锚定蛋白的表面展示表达载体；(2)将靶蛋白的基因序列克隆到所述表面展示表达载体的巴斯德毕赤酵母壁蛋白基因序列的上游，与所述巴斯德毕赤酵母壁蛋白基因形成融合基因；(3)转化巴斯德毕赤酵母，根据所述表达载体上的筛选标记筛选阳性转化子，即得到表面展示系统。所述靶蛋白为碱性木聚糖酶、米黑根毛霉脂肪酶或南极假丝酵母脂肪酶B。所述巴斯德毕赤酵母为巴斯德毕赤酵母GSl 15。上述方法中，所述的表达载体是常用的带有分泌信号肽序列的巴斯德毕赤酵母表达载体，如 PPIC9K、pPICZ α A、pPICZ α B、pPICZ α C、pGAPZ α A、pGAPZ α B、pGAPZ α C 等；如果是无信号肽的表达载体，可在靶蛋白基因序列的上游添加分泌信号肽序列。表达载体为pPIC9K时，构建表面展示表达载体后，将靶蛋白的基因序列克隆连接到所述表面展示表达载体的巴斯德毕赤酵母壁蛋白基因序列上游的限制性内切酶酶切位存、EcoR 1与Mlu I之间。本专利技术相对于现有技术所具有的优点及有益效果。本专利技术所述的壁蛋白Gcw51是巴斯德毕赤酵母内源壁蛋白，且在毕赤酵母中表达量十分高，与现已用于巴斯德毕赤酵母表面展示系统的内源锚定蛋白Pirl蛋白和Pir2蛋白相比，分别高9倍和21倍。因此，本专利技术所述巴斯德毕赤酵母可用于构建高表达效率的巴斯德毕赤酵母表面展示系统。附图说明图1.用SDS法和β-1，3-葡聚糖酶法提取巴斯德毕赤酵母壁蛋白Gcw51的 Wfestern blot结果。a. SDS法提取壁蛋白Gcw51 ;b. β _1，3-葡聚糖酶法提取壁蛋白 Gcw51 ο图2 重组菌GS115/GCW51和对照菌GS115的流式细胞仪检测结果。虚线对照菌 GS115 ；实线重组菌 GS115/GCW51。图3 三丁酸甘油酯乳化平板水解圈法检测GS115/GCW51-CALB阳性转化子。a.对照菌 GS115 ；b.阳性转化子 GSll5/GCW51-CALB。图4 荧光显微镜验证融合蛋白GCW51-CALB在毕赤酵母细胞壁表面展示结果。a. GS115/GCW51-CALB的普通光学显微b.GS115/GCW51-CALB 的荧光显微c.对照菌GS115的普通光学显微d.对照菌GS115的荧光显微图。图5 菌体酶活曲线图。其中，令表示重组菌GS115/GCW51-CALB的菌体酶活曲线； Γ表示对照菌GSl 15的菌体酶活曲线。图6 采用Gcw51、Pirl和Pir2作为锚定蛋白展示CALB的酶活比较。术语解释MD平板13. 4g/L酵母氮源，4X 10_4 g/L生物素，20g/L葡萄糖和20g/L琼脂 BMGY培养基20g/L蛋白胨，10g/L酵母提取物，100 mM磷酸钾缓冲液(pH6. 0)，13. 4g/ L酵母氮源，4X10_4 g/L生物素，10g/L甘油。BMMY培养基20g/L蛋白胨，10g/L酵母提取物，100 mM磷酸钾缓冲液(pH6. 0)， 13.4g/L酵母氮源，4X10_4 g/L生物素，5g/L甲醇。三丁酸甘油酯乳化平板13. 4g/L酵母氮源，10g/L三丁酸甘油酯，5g/L聚乙烯醇，20g/L琼脂，IOOmM磷酸盐缓冲液(pH6. 0)。具体实施例方式实施例1 巴斯德毕赤酵母壁蛋白GCW51基因的克隆、表达和鉴定 (1)巴斯德毕赤酵母壁蛋白GCW51基因的克隆根据巴斯德毕赤酵母壁蛋白GCW51的基因序列SEQ NO. 4以及巴斯德毕赤酵母质粒 PPIC9K上的多克隆位点特征，设计合成引物其中引物Pl方框部分为^boTP I酶切位点，下划线部分为I酶切位点，斜体部分为 FLAG标签序列；引物Ρ2下划线部分为Λ^ I酶切位点。以巴斯德毕赤酵母GS115基因组 DNA为模本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种巴斯德毕赤酵母壁蛋白Ｇｃｗ５１，其特征在于，该蛋白的氨基酸序列如ＳＥＱ ＮＯ：１所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：林影，张莉，周新莹，叶燕锐，韩双艳，郑穗平，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：81
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