一种用于生产大菱鲆免疫球蛋白的方法技术

本发明专利技术涉及一种用于生产大菱鲆免疫球蛋白的方法，其特征在于是利用牛血清白蛋白BSA作为抗原来免疫大菱鲆；具体是通过三次免疫操作后，在从第一次免疫起8～10周内通过亲和层析的方法获得大菱鲆抗BSA的免疫球蛋白。本发明专利技术克服了生化领域对BSA的惯常用法，将其作为抗原经过特定的免疫程序来免疫大菱鲆，从而获得高效价的抗BSA特异性抗体。本发明专利技术的方法解决了长期以来大菱鲆免疫研究缺乏足够特异性免疫球蛋白的难题。同时采用的BSA具有结构简单，成分单一，不易对免疫结果产生干扰，而且易获得等优点。在水产动物中可建立以BSA为模式蛋白，并形成以BSA为基础的研究模式。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于水产动物免疫学研究
，具体涉及一种用于生产大菱鲆免疫球蛋白的方法。
技术介绍
对于鱼类整个免疫系统以及免疫应答规律等的基础研究，都依赖于对免疫球蛋白的研究，它是鱼体免疫应答的主要介质。因此对免疫球蛋白的研究也是鱼类免疫学研究的重点和热点。这其中如何使鱼体发生免疫应答以及如何获得高纯度的免疫球蛋白是研究的关键。在大菱鲆免疫研究中，以往主要采用将病原制成疫苗免疫鱼体，使之产生特异性抗体，然后通过饱和硫酸铵沉淀、凝胶过滤等技术对抗体进行纯化，来研究免疫球蛋白的特性。但通过这些方法获得的免疫球蛋白，其活性、纯度以及数量都是有限的，而且操作步骤较为繁琐，不利于深入、精确的研究免疫球蛋白的特性及其发生机理。究其原因主要是：一方面，以病原作为抗原，其结构复杂，性状不稳定，变种多，产生的抗体含有不确定性因素较多；另一方面，目前常用的免疫球蛋白纯化方法操作较为繁琐，在纯化过程易损失蛋白。因此，在大菱鲆免疫球蛋白的研究过程中，长期以来一直未能找到合适的抗原来获得抗体，一定程度上限制了免疫球蛋白研究的发展，致使诸如大菱鲆免疫球蛋白的类型、数量、基因、应答机理、调控机理等方面的研究不能深入。因此，有必要寻找一个结构简单、稳定、易获得且价廉的优质抗原激起大菱鲆鱼体免疫应答反应，再通过此抗原耦合的亲和层析柱纯化免疫球蛋白，操作简单，获得的免疫球蛋白纯度高，利于对其进行深入的研究和探讨。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于生产大菱鲆免疫球蛋白的方法，能够有效解决大菱鲆的免疫研究中缺乏有效的抗原，特异性免疫球蛋白数量不足的问题。申请人在长期的研究中发现牛血清白蛋白BSA能有效的诱使大菱鲆发生免疫反应，并通过创造性劳动后建立了具体的免疫方法。本专利技术的用于生产大菱鲆免疫球蛋白的方法，其特征是利用牛血清白蛋白(BSA)作为抗原来免疫大菱鲆。本专利技术的免疫方法，包括如下步骤：1)第一次免疫：将BSA与弗氏完全佐剂等比例混匀乳化制成疫苗，以0.5ml/kg鱼体重肌肉注射健康大菱鲆；2)第二次免疫：第一次免疫14天后将BSA与弗氏不完全佐剂等比例混匀乳化制成疫苗，以0.5mL/kg鱼体重肌肉注射第一次免疫的大菱鲆；3)第三次免疫：第二次免疫14天后将BSA与弗氏不完全佐剂等比例混匀乳化制成疫苗，以0.5mL/kg鱼体重肌肉注射第一次免疫的大菱鲆完成免疫；在从第一次免疫起1～10周内通过亲和层析的方法获得大菱鲆抗BSA的免疫球蛋白。优选采用免疫后8～10周的高效价血清，通过亲和层析的方法获得大菱鲆抗BSA的免疫球蛋白。所述的亲和层析的方法，具体操作如下：将BSA-琼脂糖装入10×0.5cm层析柱中，以0.01mol/L磷酸盐缓冲液预洗后，将大菱鲆免疫血清与等体积磷酸盐缓冲液混合，过滤后上层析柱，PBS洗涤；用10ml洗脱液将大菱鲆抗BSA的免疫球蛋白洗脱下来并作为单一组分收集；立即用1.2ml 0.1mol/L Tris-HCl中和；置0.01mol/L磷酸缓冲液中4℃透析获得大菱鲆免疫球蛋白。上述的洗脱液为含0.15mol/L NaCl的0.1mol/L甘氨酸-NaOH溶液，洗脱液pH值为11.0。本专利技术克服了生化领域对BSA的惯常用法，将其作为抗原经过特定的免疫程序来免疫大菱鲆，从而获得高效价的抗BSA特异性抗体。本专利技术的方法解决了长期以来大菱鲆免疫研究缺乏足够特异性免疫球蛋白的难题。同时采用的BSA具有结构简单，成分单一，不易对免疫结果产生干扰，而且易获得等优点。在水产动物中可建立以BSA为模式蛋白，并形成以BSA为基础的研究模式。附图说明图1：间接ELISA法测定BSA免疫大菱鲆后血清抗体效价的变化图。图2：SDS-PAGE初步分析应用不同方法纯化的免疫球蛋白效果对比图。其中箭头所示位置为免疫球蛋白的重链(上端)和轻链(下端)，M-marker、1、辛酸-(NH4)2SO4沉淀法纯化的免疫球蛋白；2、根据等电点进行透析纯化的免疫球蛋白；3、在第2步基础上，过sephadex-G200凝胶柱，纯化的免疫球蛋白；4、免疫亲和层析法纯化的特异性免疫球蛋白。具体实施方式本专利技术采用的牛血清白蛋白(BSA)，又称第五组分，是牛血清中的一种简单的球蛋白，由583个氨基酸残基组成，分子量为66.430kDa，等电点为4.7。BSA在生化实验中有广泛的应用，例如在western blot中作为封闭液；BSA也是一种常用的载体蛋白，将其交联于半抗原和其他弱抗原可以使它们在抗体生产中具有更强的免疫原性。在已有的免疫学研究中，未见直接将BSA作为抗原的应用报道。本专利技术将BSA引入鱼类免疫学研究中，开辟一条研究免疫球蛋白的新途径，从而克服以往方法的不足。本专利技术的具体方法如下：1)第一次免疫：将BSA与弗氏完全佐剂等比例混匀乳化制成疫苗，以0.5mL/kg鱼体重肌肉注射健康大菱鲆；2)第二次免疫：第一次免疫14天后将BSA与弗氏不完全佐剂等比例混匀乳化制成疫苗，以0.5mL/kg鱼体重肌肉注射第一次免疫的大菱鲆；3)第三次免疫：第二次免疫14天后将BSA与弗氏不完全佐剂等比例混匀乳化制成疫苗，以0.5mL/kg鱼体重肌肉注射第一次免疫的大菱鲆完成免疫；在从第一次免疫起1～10周内定期采集免疫的大菱鲆血液，经检验，采用免疫后8～10周的高效价血清，通过亲和层析的方法获得大菱鲆抗BSA免疫球蛋白。在大菱鲆免疫过程中，免疫剂量的选择、免疫程序等都是影响抗体的产生、抗体的质量及数量的因素。为了获得大量的抗血清，本专利技术中选取平均体重500g的大菱鲆，在确定好佐剂及免疫剂量后，确立免疫程序就很重要。在定期采样检测中发现，通常采用的2次免疫程序并没有使大菱鲆体内产生足够的免疫球蛋白。本专利技术中采用了3次免疫的程序，经过检测，达到了预期的效果，鱼体产生了高水平的抗体；而更多次数得免疫并没有使免疫效果提高，并且多次注射还容易使鱼体产生应激反应。在免疫期间对免疫的大菱鲆定期取血(尾静脉取血)，分离血清，通过间接酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清中抗BSA的特异性抗体效价，作为评估指标。特异性抗体检验方法(间接ELISA)建立：以0.05mol/L(pH＝9.6)碳酸盐溶液稀释BSA至2μg/mL，取50μL稀释液加入酶标板孔中，置4℃冰箱中过夜包被，次日以0.01mol/L(pH＝7.4)PBST(0.05％Tween-20)洗涤3次，每次3m本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种用于生产大菱鲆免疫球蛋白的方法，其特征在于是利用牛血清白蛋白ＢＳＡ作为抗原来免疫大菱鲆。

【技术特征摘要】
1.一种用于生产大菱鲆免疫球蛋白的方法，其特征在于是利用牛血清白蛋
白BSA作为抗原来免疫大菱鲆。
2.权利要求1所述的生产大菱鲆免疫球蛋白的方法，其特征在于包括如下
步骤：
1)第一次免疫：将BSA与弗氏完全佐剂等比例混匀乳化制成疫苗，以0.5
ml/kg鱼体重量注入健康大菱鲆；
2)第二次免疫：第一次免疫14天后将BSA与弗氏不完全佐剂等比例混匀
乳化制成疫苗，以0.5mL/kg鱼体重量注入第一次免疫的大菱鲆；
3)第三次免疫：第二次免疫14天后将BSA与弗氏不完全佐剂等比例混匀
乳化制成疫苗，以0.5mL/kg鱼体重量注入第一次免疫的大菱鲆完成免疫；
在从第一次免疫起1～10周内通过亲和层析的方法获得大菱鲆抗BSA的免疫球
蛋白。
3.如权利要求2所述的生产大菱鲆免疫球蛋白的方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：王蔚芳，李青梅，甘玲玲，张改平，雷霁霖，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黄海水产研究所，
类型：发明
国别省市：95