本发明专利技术公开了一种含LDV序列短肽的聚乙二醇化衍生物，其制备方法，含它们的组合物。本发明专利技术的含LDV序列短肽的聚乙二醇化衍生物由含LDV序列短肽和与含LDV序列短肽C端共价连接的聚乙二醇组成，其中含LDV序列短肽具有下式结构：X-Y1-Ile-Leu-Asp-Val-Y2-Y3-Z或X-Leu-Asp-Val-Y3-Z以上结构中，X是H或Ac；Y1是Lys或Glu；Y2是Pro或Ala；Y3是Cys或高Cys或Lys或Arg或His，是PEG修饰的残基；Z是OH或NH2。本发明专利技术给出的含LDV序列短肽的聚乙二醇化衍生物可用于制备防治慢性炎症和自身免疫性疾病的药物或药物的前体化合物。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种含阻断FN及VCAM-I等配体与整合蛋白α4β 1结合的关键序列 LDV短肽的聚乙二醇化衍生物，属于医药
技术介绍
整合蛋白α 4β 1主要表达在淋巴细胞、嗜酸性粒细胞等炎症细胞表面，其与配体纤维粘连蛋白(FN)、血管细胞粘附分子-I(VCAM-I)的相互作用是炎症启动和发展过程中的关键步骤，在许多慢性炎症和自身免疫性疾病如哮喘、类风湿性关节炎、多发性硬化症、 炎性肠道疾病中发挥重要作用。干扰整合蛋白α 4β1与配体的结合可达到治疗许多慢性炎症和自身免疫性疾病的目的。LDV(Leu-Asp-Val)是FN、VCAM-I与整合蛋白α 4 β 1结合的关键序列，近年来整合蛋白α 4β1的肽类拮抗剂研究较多以LDV序列为基础进行。但是，与其它肽类药物的性质相似，目前已经合成的众多整合蛋白α 4β 1拮抗肽由于分子量小，易被清除和酶解破坏，其体内代谢时间很短，较大的治疗剂量和频繁、较短的给药时间间隔可能成为其应用的重要障碍。利用聚乙二醇(Polyethlene glycol, PEG)修饰可以增加蛋白质和多肽药物的稳定性、延长血浆半衰期、增加生物利用度等性能，我们进行了 LDV及其相关肽的PEG修饰研究工作。研究提示，对于基于配体序列设计合成的LDV及其衍生的整合蛋白α4β 1拮抗肽， 由于能够部分解释整合素-配体相互作用的结构特征，因此其PEG修饰是可行的，甚至对提高药物生物利用度、降低给药剂量和延长给药间隔时间前景乐观。2004年，P印insky RB等报告了 PEG修饰LDV衍生物B0I5192及其构效关系分析的研究结果(ASpetOurnalS，2005，2 :742-750)。研究表明，修饰产物血浆半衰期明显增加 (修饰前后分别为1. Ih和17. 9h)、清除率显著降低(修饰前后分别为426ml/h/kg和6. 2ml/ h/kg)。未经修饰的B0I5192在S. C途径给药时对EAE模型的实验治疗有效剂量高达30mg/ kg，而BI05192的PEG修饰产物剂量降低至每周lmg/kg仍可维持锁定整合蛋白α 4β 1功能的水平。P印inskyRB等的研究验证了对LDV及其衍生的整合蛋白α 4 β 1拮抗肽进行PEG 修饰的可行性。分析蛋白类药物PEG修饰的既往研究资料，对同一被修饰对象，PEG修饰位点、共价连接PEG的数量及PEG的种类，都可能对修饰产物活性产生较大影响。并且，在被修饰物和PEG之间，PEG分子量越大，可能引起修饰产物的活性下降越多，被修饰物分子量越小则其活性部位被屏蔽的可能性越大。根据以上分析，适当分子量PEG及种类的选择是保证有效延长被修饰物半衰期， 增加被修饰物生物活性，同时避免被修饰物活性部位被较多屏蔽的首要因素。另一方面， Pepinsky RB等以LDV衍生物氨基基团作为修饰位点的PEG修饰方案仍存在反应条件不易控制，以及影响修饰产物产率及纯度、增加合成(生产)成本等不利因素。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种含LDV序列短肽的聚乙二醇化衍生物，为科学研究和临床治疗提供一种新的结构简单，合成反应条件温和、简便、可控的药物分子或前体化合物， 也为肽类药物的改造和聚乙二醇化修饰研究提供新的方法和思路。本专利技术的技术解决方案是对采用化学合成和基因重组方法制备的含LDV序列短肽进行C末端的聚乙二醇定点修饰，获得具有较长体内半衰期和良好抗炎免疫药理活性的含LDV序列短肽的聚乙二醇化衍生物。本专利技术的含LDV序列短肽的聚乙二醇化衍生物由含LDV序列短肽和与含LDV序列短肽共价连接的聚乙二醇组成，其中的含LDV序列短肽具有下式结构X-Y1-Ile-Leu-Asp-Val-Y2-Y3-Z 或 X-Leu-Asp-Val-Y3-Z其中，X是H或Ac J1是Lys或Glu J2是Pro或Ala ;Y3是Cys或高Cys或Lys或 Arg或His，是PEG修饰的残基；Z是OH或NH2。本专利技术所说的含LDV序列短肽的聚乙二醇化衍生物的制备方法，包括以下步骤用化学合成方法或基因工程方法制备供修饰的前体含LDV序列短肽；前体含LDV 序列短肽C端与聚乙二醇进行共价连接。本专利技术中的含LDV序列短肽的制备方法可使用本领域公知的任何方法进行制备， 此制备方法优选为固相和液相化学合成法。固相方法包括使用Fmoc或Boc保护的氨基酸， 用多肽合成仪或手工合成法进行氨基酸序列的合成，再经切除，经高效液相(HPLC)分离纯化，冻干，所得肽段为进行聚乙二醇修饰的中间体前体。本专利技术中的含LDV序列短肽也可用基因工程法制备，包括以下步骤(1)按含LDV序列短肽的氨基酸序列合成基因片段。(2)基因片段经连接，转化，筛选得到阳性菌株。(3)菌株经发酵，收集菌体，破壁，抽提得到包涵体。(4)包涵体裂解，分离得到粗品，经HPLC分离纯化，冻干，所得肽段为进行聚乙二醇修饰的中间体前体。 本专利技术的含LDV序列短肽的聚乙二醇化衍生物，该聚乙二醇在含LDV序列短肽的C 端进行修饰，其特点是含LDV序列短肽的C端可以连接在聚乙二醇的一个末端或其两个末端。聚乙二醇的分子量范围为2000Da-80000Da，优选为5000Da_40000Da。本专利技术的含LDV序列短肽的聚乙二醇化衍生物的制备方法包括以下步骤(1)制备或获得含迈克尔加成反应(Michael addition reaction)受体的聚乙二醇与含迈克尔加成反应给体的含LDV序列短肽；或含迈克尔加成反应给体的聚乙二醇与含迈克尔加成反应受体的含LDV序列短肽。(2)进行迈克尔加成反应，用其受体或给体的聚乙二醇和含LDV序列短肽进行反应，形成含LDV序列短肽的聚乙二醇化衍生物，如含马来酰亚胺衍生的聚乙二醇与含半胱氨酸的含LDV序列短肽反应而形成产品。如果如本专利技术所述含LDV序列短肽结构中Y3是Cys或高Cys，则聚乙二醇是用硫醚键或双硫键共价结合；如果Y3是1^8，则聚乙二醇是用酰胺键或二级胺而共价结合；如果 Y3是His，则聚乙二醇是用组氨酸的咪唑环而共价结合；如果Y3是Arg，则聚乙二醇是通过杂环而连接的。本专利技术的化合物是含LDV序列短肽的聚乙二醇化衍生物，亦包括为进行聚乙二醇修饰而产生的新的中间体，是用于制备防治慢性炎症或自身免疫病的药物或药物的前体化合物。药代学研究证实，较大分子量mPEG修饰含LDV序列短肽较原型(前体)含LDV序列短肽血浆半衰期和相对生物利用度明显增高。mPEG修饰含LDV序列短肽对豚鼠和小鼠的实验性哮喘及其支气管EOS的浸润和渗出，对哮喘小鼠血清和BALF中Eotaxin水平、肺组织Eotaxin、CCR3蛋白及其mRNA的表达、病理组织学检查的炎症表现表现了较强的拮抗作用。在含LDV序列短肽等摩尔浓度剂量下，以及修饰物含原型含LDV序列短肽分别为1/9. 74 和1/4. 12时药效优于其原型(前体化合物)。修饰用mPEG分子量较大时产物活性较强。 实验肯定了 PEG修饰后产物相对生物利用度的增加，证明LDV类肽的PEG修饰达到了预期充分暴露配体结合部位、保留原化合物药理活性的合成目的。本专利技术取得了以下技术进步与未经聚乙二醇修饰的含LDV序列短肽前体比较，适当分子量的聚乙二醇修饰提高了含LDV序列短肽前体的体内半衰本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种含ＬＤＶ序列短肽的聚乙二醇化衍生物，其特征在于：由含ＬＤＶ序列短肽和与ＬＤＶ序列短肽共价连接的聚乙二醇组成，其中的含ＬＤＶ序列短肽具有下式结构：Ｘ－Ｙ１－Ｉｌｅ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｖａｌ－Ｙ２－Ｙ３－Ｚ或Ｘ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｖａｌ－Ｙ３－Ｚ其中，Ｘ是Ｈ或Ａｃ；Ｙ１是Ｌｙｓ或Ｇｌｕ；Ｙ２是Ｐｒｏ或Ｌ－Ｐｒｏ或Ａｌａ；Ｙ３是Ｃｙｓ或高Ｃｙｓ或Ｌｙｓ或Ａｒｇ或Ｈｉｓ，是ＰＥＧ修饰的残基；Ｚ是ＯＨ或ＮＨ２。
【技术特征摘要】
1.一种含LDV序列短肽的聚乙二醇化衍生物，其特征在于由含LDV序列短肽和与LDV 序列短肽共价连接的聚乙二醇组成，其中的含LDV序列短肽具有下式结构X-Y1-Ile-Leu-Asp-Val-Y2-Y3-Z 或 X-Leu-Asp-Val-Y3-Z其中，X是H或Ac J1是Lys或Glu ;Y2是Pro或L-Pro或Ala ；Y3是Cys或高Cys或 Lys或Arg或His，是PEG修饰的残基；Z是OH或NH2。2.根据权利要求1所述的含LDV序列短肽的聚乙二醇化衍生...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵铁华，朱鸣阳，史子惠，甄晓兰，
申请(专利权)人：河北师范大学，
类型：发明
国别省市：13
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