非活化碳-碳双键还原酶及其编码基因与应用制造技术

本发明专利技术涉及一种非活化碳-碳双键还原酶基因的克隆、表达及用于还原香叶醇的非活化碳-碳双键。该酶是如下1)或2)的蛋白质：1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加的由1)衍生的蛋白质。将该蛋白的编码基因导入大肠杆菌后构成的重组大肠杆菌。实验证明：本发明专利技术提供的重组大肠杆菌所产蛋白具有还原非活化碳-碳双键的催化活性，通过气相色谱与质谱联用(GC-MS)检测证实，上述蛋白将香叶醇的非活化碳-碳双键还原从而生成香茅醇。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程领域，具体地，涉及一种非活化碳-碳双键还原酶及其编码基因与应用。
技术介绍
新基因和新酶资源是工业生物技术发展的驱动力。系统深入地发掘具有生物催化潜力的酶基因，不仅能为新颖的生物催化剂的研制提供主效基因来源，还有助于通过酶工程(如定向进化)改良酶的催化性能，加速实现酶催化的工业应用。生物催化剂包括酶和完整细胞，碳_碳双键还原酶属于新型生物催化用酶，主要应用于医药等精细化学品的合成。含吸电子基团(如酮、醛、酸、酸酐、酯、内酯、硝基等)的α，β碳-碳双键称为活化的碳_碳双键，反之则为非活化的碳_碳双键。12-氧-植物二烯酸还原酶 (12-oxo-phytodienoic acid reductase, 0PR)是茉莉酸生物合成中的一个关键酶，它催化 12-氧-植物二烯酸五元环上活化的碳-碳双键的还原。目前，尽管对拟南芥、水稻等几个物种的OPR进行了生化和遗传方面的研究，也有研究发现异源表达的番茄OPR能够催化活化的碳_碳双键发生还原反应，表现出一定的生物催化应用潜力。但是，对于OPR还原非活化的碳_碳双键的催化活性研究还未见报道。以完整细胞作为生物催化剂对非活化碳_碳双键的还原反应研究，则有一例。詹喜等(有机溶剂中固定化酵母细胞催化香叶醇还原生物转化的研究.浙江大学学报-农业与生命科学版2006，32 (4) :391-395.)通过筛选不同的酵母菌株对香叶醇非活化碳-碳双键的还原活性，发现Baker' s酵母还原香叶醇非活化碳_碳双键的催化活力最强，但至今仍并不清楚究竟是细胞内的哪一种酶在发挥作用。通常情况下，天然酶在细胞内的含量极其微小，因而作为生物催化剂的应用潜力受到局限。而通过基因重组和异源表达技术产生的酶量可能超出该酶在出发细胞内含量的数千倍以上，这一点对规模化制备酶催化剂尤为重要。本专利涉及的利用重组菌高表达 12-氧-植物二烯酸还原酶并将其应用于非活化碳_碳双键还原反应的研究尚未见文献报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种非活化碳_碳双键还原酶及其编码基因与应用。为了实现本专利技术的上述目的，本专利技术提供了如下的技术方案非活化碳-碳双键还原酶EaOPR，(a)其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示；(b)将(a)中的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代，缺失或添加且具有酶EaCffR活性的由(a)衍生的蛋白质。所述的非活化碳-碳双键还原酶EaCPR的编码基因EaOPR基因。所述的非活化碳-碳双键还原酶EaOPR的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO=I 所示。所述的非活化碳-碳双键还原酶EaCffR的编码基因为如下(a)-(d)中任一所述的基因(a)其编码序列是序列表中序列1的自5'末端第1-1155位；(b)其核苷酸序列是序列表中序列1的自5'末端第1-1152位；(c)在严格条件下与(a)或(b)的基因杂交且编码所述蛋白的基因，所述严格条件为用0. IX SSPE或0. 1XSSC，0. 1% SDS的溶液，在DNA或RNA杂交实验中65°C下杂交并洗膜；(d)与(a)或(b)的基因具有90%以上的同源性且编码所述蛋白的基因。扩增上述所述的非活化碳-碳双键还原酶EaCffR的编码基因全长或其任一片段的引物。含有上述的非活化碳-碳双键还原酶EaOPR的编码基因的表达载体。含有上述的非活化碳-碳双键还原酶EaOPR的编码基因的细胞系。含有上述的非活化碳-碳双键还原酶EaOPR的编码基因的宿主菌。所述的非活化碳-碳双键还原酶EaOPR在还原非活化碳-碳双键催化活性中的应用。 所述的非活化碳-碳双键还原酶EaOPR编码基因在还原非活化碳-碳双键催化活性中的应用。本专利技术所提供的非活化碳_碳双键还原酶，名称为EaOPR，来源于小檗科植物粗毛淫羊藿(Epimedium acuminatum Franch)，是如下1)或2)的蛋白质1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加的由1)衍生的蛋白质。为了使1)中的EaCffR便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签序列。表1.标签的序列本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．非活化碳－碳双键还原酶ＥａＯＰＲ，（ａ）其氨基酸序列如ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２所示；（ｂ）将（ａ）中的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代，缺失或添加且具有酶ＥａＯＰＲ活性的由（ａ）衍生的蛋白质。

【技术特征摘要】
1.非活化碳-碳双键还原酶EaOPR，(a)其氨基酸序列如SEQID NO 2所示；(b)将(a)中的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代，缺失或添加且具有酶 EaCffR活性的由(a)衍生的蛋白质。2.权利要求1所述的非活化碳_碳双键还原酶EaOPR的编码基因EaOPR基因。3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于所述的非活化碳-碳双键还原酶EaCffR的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。4.根据权利要求2所述的基因，其特征在于该编码基因为如下(a)-(d)中任一所述的基因(a)其编码序列是序列表中序列1的自5'末端第1-1155位；(b)其核苷酸序列是序列表中序列1的自5'末端第1-1152位；(c)在严格条件下与(a)或(b)的基因杂交且编码所述蛋白的基因，所述严格条件为用 0. IX SSP...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾英，袁田田，陈倩倩，赵沛基，
申请(专利权)人：中国科学院昆明植物研究所，
类型：发明
国别省市：53