抗南方根结线虫黄瓜渐渗系材料的培育方法技术

本发明专利技术属于生物技术育种领域，涉及抗南方根结线虫黄瓜渐渗系材料的培育方法。本发明专利技术通过野生种与栽培种的种间杂交，染色体加倍获得双二倍体新种，经回交、自交获得种间渐渗系，再对黄瓜渐渗系利用人工苗期卵液接种法进行鉴定，鉴定结果发现渐渗系10299F-5的病情指数均为2.0，表现为抗病，由此得到抗南方根结线虫病的黄瓜种间杂交渐渗系材料。该抗南方根结线虫病的黄瓜种间杂交渐渗系材料农艺性状优良，可直接作为育种材料，不仅填补了黄瓜抗南方根结线虫资源的空白，还为其它植物的接种鉴定提供参考，而且为今后黄瓜品种的改良、抗病基因转移、基因定位、分子标记、基因克隆等提供了有用的遗传材料。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物技术育种领域，涉及。
技术介绍
南方根结线虫(Meloidogyne incognita)是危害黄瓜(Cucumis sativus L.)生产的主要病原线虫[1、2]，全球每年因此而造成的损失高达1000亿美元以上[3]，年损失率约10% [4]，已成为影响黄瓜生产的严重障碍之一。目前在黄瓜栽培种中尚未发现抗南方根结线虫的种质资源[5~6~7]。由于黄瓜遗传基础非常狭窄，变异率仅为3-8% [8]，因此，通过种内变异获得抗南方根结线虫黄瓜品种是难以实现的。诸多研究表明，甜瓜属一些近缘野生禾中，如 C. metuliferus E.Meyer ex Naudin, C. anguria L. , C. ficifolius A. Rich, C. heptadactylus Naud. , C. Iongipes Hook 禾口 C. hystrix Chakr 等，对南方*艮结线虫具有抗性[9、1(1]，因此，通过远缘杂交转移近缘野生种中的抗性基因以拓宽黄瓜遗传基础，并选育抗病新品种是一条解决黄瓜抗性问题的有效途径。远缘杂交是创造新物种、新材料的有效途径之一，同时可以向栽培作物中导入外源有益基因，扩大作物的遗传基础，提高作物的抗病、抗逆性等。在栽培黄瓜的近缘物种中， 蕴藏着许多对黄瓜改良及其有用的基因，很早就受到葫芦科育种者的重视，但由于种间杂交严重不亲和，杂交后代的不育，许多试验均未取得成功。陈劲枫于1989年在我国云南西双版纳采集到1个甜瓜属珍稀野生种(C. hystrix Chakr.)，实验证明其具有多种抗病性， 如抗蔓枯病、根结线虫病等多种病害，并成功的获得了其与栽培品种之间的种间杂种F1, 利用体细胞无性系变异途径加倍杂种染色体，获得了人工双二倍体新种质(C.hytivus)， C. hytivus可作为遗传桥梁，通过与栽培黄瓜品种不断回交、自交，得到黄瓜-酸黄瓜种间杂交渐渗系，这些渐渗系经分子标记验证已含有酸黄瓜野生种C. hystrix的部分片段[11]。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种。本专利技术的另一目的是提供黄瓜抗南方根结线虫材料的筛选鉴定方法，该方法同时也可为其他作物抗根结线虫病接种鉴定提供参考。本专利技术的目的可通过如下技术方案实现，包含如下步骤(1)黄瓜种间杂交渐渗系的获得以栽培黄瓜‘北京截头’为父本，野生种酸黄瓜为母本杂交获得杂种F1,杂种F1通过胚胎拯救结合体细胞无性系变异对其染色体进行加倍，加倍后获得种间双二倍体新种，命名为Cucumis hytivus,以双二倍体新种Cucumis hytivus为母本，与栽培品种‘北京截头’回交1 2代，然后再自交3 5代获得其多代回交自交后代群体株系，即黄瓜种间杂交渐渗系；(2)黄瓜种间杂交渐渗系抗南方根结线虫接种鉴定制备ImL含1000个虫卵的南方根结线虫接种液，按照2000卵/株的接种量接种步骤(1)获得的黄瓜种间杂交渐渗系幼苗，接种8周后将黄瓜种间杂交渐渗系植株的根剪下，统计每株根系的根结数及卵块数，按如下公式计算病级指数DI，1 < DI < 2的株系即为抗南方根结线虫黄瓜渐渗系材料DI =Σ (Sini)/N ；其中si为发病级别，ni为相应发病级别的株数，i =病情分级的各个级别，N =调查总株数，发病级别si的分级标准为0级无根结；1级1 2个根结和卵块；2级3 10个根结和卵块；3级11 30个根结和卵块；4级31 100个根结和卵块；5级100个以上根结和卵块。所述的所述的野生种酸黄瓜较栽培黄瓜‘北京截头’提前2个月播种，并对其进行 40d以上的光照处理，使两者花期相遇。所述的黄瓜种间杂交渐渗系抗南方根结线虫接种鉴定具体步骤如下1)病原物繁殖与保存将南方根结线虫卵接种到感病番茄品种‘苏粉2号’上，于温室中进行繁殖保存备用，每3个月转接一次；2)病原物分离将番茄的根从植株上剪下，冲洗干净，然后将含有卵块的根切成 l-2mm的小段，按Ig病根加IOOml的比例加入0. 5 %的次氯酸钠盐溶液，充分振荡2 ％iin， 使病根中的卵从卵块中解脱出来，迅速依次过60、200及500目筛过滤，洗下的卵再立即用自来水清洗干净，得到卵液后取Iml进行镜检，利用计数皿确定其浓度；3)接种待黄瓜幼苗长到3-4片真叶时接种南方根结线虫卵液，接种量为2000卵 /株，接种后温度维持在25°C ^°C，进行正常的肥水管理；4)鉴定接种8周后将所有植株的根剪下，去掉根上的基质，将根洗干净后调查统计每株根系的根结数及卵块数，按如下公式计算病级指数DI，1 < DI ^ 2的株系即为抗南方根结线虫黄瓜渐渗系材料DI =Σ (Sini)/N;其中si为发病级别，ni为相应发病级别的株数，i =病情分级的各个级别，N =调查总株数，发病级别si的分级标准为0级无根结；1级1 2个根结和卵块；2级3 10个根结和卵块；3级11 30个根结和卵块；4级31 100个根结和卵块；5级100个以上根结和卵块。所述的南方根结线虫卵接种感病番茄品种‘苏粉2号’前以单卵块接种法进行纯化。所述的接种步骤前还包括黄瓜材料的育苗步骤和移苗步骤，具体方法如下育苗将获得的各株系黄瓜种间杂交渐渗系浸种，置于恒温培养箱中催芽， 待胚根长至0. 3 0. 7cm时将种子播于装有灭菌营养土的穴盘中；移苗待幼苗长到两叶一心时，将幼苗移入装有经高温灭菌营养土的塑料钵中。所述的高温灭菌营养土为草炭和蛭石1 1混合，并经121°C灭菌所得。所述的接种步骤具体方法为待幼苗长到3 4片真叶时接种，接种参照陈劲枫 (2001)的方法，用竹棒在根周围钻2个直径0. 6cm、深2 3cm的孔，每孔加ImL含1000个虫卵的接种液，接种量为2000卵/株，接种后温室温度控制在25°C ^°C，进行正常的肥水管理，即每三天浇一次水，用市售磷酸二氢钾肥料一周浇一次肥。黄瓜抗南方根结线虫材料的筛选鉴定方法，包含以下步骤1)病原物繁殖与保存将南方根结线虫卵接种到感病番茄品种‘苏粉2号’上，于温室中进行繁殖保存备用，每3个月转接一次；2)病原物分离将番茄的根从植株上剪下，冲洗干净，然后将含有卵块的根切成 l-2mm的小段，按Ig病根加IOOml的比例加入0. 5 %的次氯酸钠盐溶液，充分振荡2 ％iin， 使病根中的卵从卵块中解脱出来，迅速依次过60、200及500目筛过滤，洗下的卵再立即用自来水清洗干净，得到卵液后取Iml进行镜检，利用计数皿确定其浓度；3)接种待黄瓜幼苗长到3-4片真叶时接种南方根结线虫卵液，接种量为2000卵 /株，接种后温度维持在25°C ^°C，进行正常的肥水管理；4)鉴定接种8周后将所有植株的根剪下，去掉根上的基质，将根洗干净后调查统计每株根系的根结数及卵块数，按如下公式计算病级指数DI，并判断黄瓜材料对南方根结线虫的抗性DI =Σ (Sini)/N ；其中si为发病级别，ni为相应发病级别的株数，i =病情分级的各个级别，N =调查总株数，发病级别si的分级标准为0级无根结；1级1 2个根结和卵块；2级3 10个根结和卵块；3级11 30个根结和卵块；4级31 100个根结和卵块；5级100个以上根结和卵块；本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．抗南方根结线虫黄瓜渐渗系材料的培育方法，其特征在于包含如下步骤：（１）黄瓜种间杂交渐渗系的获得：以栽培黄瓜‘北京截头’为父本，野生种酸黄瓜为母本杂交获得杂种Ｆ１，杂种Ｆ１通过胚胎拯救结合体细胞无性系变异对其染色体进行加倍，加倍后获得种间双二倍体新种，命名为Ｃｕｃｕｍｉｓ　ｈｙｔｉｖｕｓ，以双二倍体新种Ｃｕｃｕｍｉｓ　ｈｙｔｉｖｕｓ为母本，与栽培品种‘北京截头’回交１～２代，然后再自交３～５代获得其多代回交自交后代群体株系，即黄瓜种间杂交渐渗系；（２）黄瓜种间杂交渐渗系抗南方根结线虫接种鉴定：制备１ｍＬ含１０００个虫卵的南方根结线虫接种液，按照２０００卵／株的接种量接种步骤（１）获得的黄瓜种间杂交渐渗系幼苗，接种８周后将黄瓜种间杂交渐渗系植株的根剪下，统计每株根系的根结数及卵块数，按如下公式计算病级指数ＤＩ，１＜ＤＩ≤２的株系即为抗南方根结线虫黄瓜渐渗系材料：ＤＩ＝∑（Ｓｉｎｉ）／Ｎ；其中ｓｉ为发病级别，ｎｉ为相应发病级别的株数，ｉ＝病情分级的各个级别，Ｎ＝调查总株数，发病级别ｓｉ的分级标准为：０级无根结；１级１～２个根结和卵块；２级３～１０个根结和卵块；３级１１～３０个根结和卵块；４级３１～１００个根结和卵块；５级１００个以上根结和卵块。...

【技术特征摘要】
1.抗南方根结线虫黄瓜渐渗系材料的培育方法，其特征在于包含如下步骤(1)黄瓜种间杂交渐渗系的获得以栽培黄瓜‘北京截头’为父本，野生种酸黄瓜为母本杂交获得杂种F1，杂种F1通过胚胎拯救结合体细胞无性系变异对其染色体进行加倍，加倍后获得种间双二倍体新种，命名为Cucumis hytivus,以双二倍体新种Cucumis hytivus 为母本，与栽培品种‘北京截头’回交1 2代，然后再自交3 5代获得其多代回交自交后代群体株系，即黄瓜种间杂交渐渗系；(2)黄瓜种间杂交渐渗系抗南方根结线虫接种鉴定制备ImL含1000个虫卵的南方根结线虫接种液，按照2000卵/株的接种量接种步骤(1)获得的黄瓜种间杂交渐渗系幼苗， 接种8周后将黄瓜种间杂交渐渗系植株的根剪下，统计每株根系的根结数及卵块数，按如下公式计算病级指数DI，1 < DI < 2的株系即为抗南方根结线虫黄瓜渐渗系材料DI =Σ (Sini)/N ；其中si为发病级别，ni为相应发病级别的株数，i =病情分级的各个级别，N =调查总株数，发病级别si的分级标准为0级无根结；1级1 2个根结和卵块；2级3 10个根结和卵块；3级11 30个根结和卵块；4级31 100个根结和卵块； 5级100个以上根结和卵块。2.根据权利要求1所述的抗南方根结线虫黄瓜渐渗系材料的培育方法，其特征在于所述的野生种酸黄瓜较栽培黄瓜‘北京截头’提前2个月播种，并对其进行40d以上的光照处理，使两者花期相遇。3.根据权利要求1所述的抗南方根结线虫黄瓜渐渗系材料的培育方法，其特征在于所述的黄瓜种间杂交渐渗系抗南方根结线虫接种鉴定具体步骤如下1)病原物繁殖与保存将南方根结线虫卵接种到感病番茄品种‘苏粉2号’上，于温室中进行繁殖保存备用，每3个月转接一次；2)病原物分离将番茄的根从植株上剪下，冲洗干净，然后将含有卵块的根切成l_2mm 的小段，按Ig病根加IOOml的比例加入0. 5%的次氯酸钠盐溶液，充分振荡2 ％iin，使病根中的卵从卵块中解脱出来，迅速依次过60、200及500目筛过滤，洗下的卵再立即用自来水清洗干净，得到卵液后取Iml进行镜检，利用计数皿确定其浓度；3)接种待黄瓜幼苗长到3-4片真叶时接种南方根结线虫卵液，接种量为2000卵/株， 接种后温度维持在25°C ^°C，进行正常的肥水管理；4)鉴定接种8周后将所有植株的根剪下，去掉根上的基质，将根洗干净后调查统计每株根系的根结数及卵块数，按如下公式计算病级指数DI，1 < DI ^ 2的株系即为抗南方根结线虫黄瓜渐渗系材料DI =Σ (Sini)/N ；其中si为发病级别，ni为相应发病级别的株数，i =病情分级的各个级别，N =调查总株数，发病级别si的分级标准为0级无根结；1级1 2个根结和卵块；2级3 10个根结和卵块；3级11 30个根结和卵块；4级31 100个根结和卵块； 5级100个以上根结和卵块。4.根据权利要求3所述的抗南方根结线虫黄瓜渐渗系材料的培育方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈劲枫，张燕霞，叶德友，钱春桃，娄群峰，程春燕，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：84