一种蜂王浆多肽及其用途制造技术

本发明专利技术涉及生物医药技术领域，具体涉及一种蜂王浆多肽及其用途。本发明专利技术通过从蜂王幼虫体内提取肠道酶，模拟蜂王体内酶解环境对蜂王浆进行酶解得到3～5kDa的蜂王浆多肽，能够用于制备Aβ抑制剂。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物医药
，特别涉及一种蜂王浆多肽及其用途。
技术介绍
近年来，随着人类平均寿命的增加，老年人口的比例不断上升，我国人口老龄化日趋明显，阿尔茨海默病(Alzheimer’ s disease,AD)作为老年期痴呆最常见的类型，已经引起全社会的广泛关注。阿尔茨海默病是一种以记忆力下降和认知功能障碍为特征的复杂的多因素慢性进行性精神衰退疾病，临床表现为进行性记忆和认知能力减退、语言障碍、精神运动异常等症状。患者早期以近记忆下降为主，疾病后期远记忆也受累及，日常生活受到影响，表现为学习新知识困难，工作主动性下降，承担新任务无法胜任，并随时间推移而加重， 伴有语言障碍、计算障碍，视空间障碍，丧失日常技能，失去认知能力等。阿尔茨海默病发病隐匿，进行性加重，会给患者及其家人带来巨大的痛苦，严重阻碍着社会经济的健康稳定发展。如今，阿尔茨海默病已成为继心脏病、肿瘤和中风之后的第四大杀手，国际国内针对阿尔茨海默病的治疗还没有特效药物，且其综合治疗疗程长、显效慢。国际国内学者对阿尔茨海默病的研究结果表明，阿尔茨海默病发病机制非常复杂，其确切病机目前尚不清楚，同大多数其他长期性疾病一样，阿尔茨海默病是由多因素导致的，由此形成了多种假说。但众多的研究证明，Αβ级联假说是目前阿尔茨海默病发病机理的主流学说，该假说指出Aβ的过度积累是AD发病的基础，而Αβ产生与清除的失衡是导致其过度累积的原因。蜂王浆(Royal Jelly,RJ)又名蜂皇浆，俗称蜂王乳，是6-18日龄青年工蜂的下咽头腺和上颚腺等腺体所分泌的特殊物质。蜂王浆呈乳白色或淡黄色，半透明，微黏稠，有特殊香味，味酸、涩、辛、微甜，主要为蜂王的终身食物及工蜂幼虫孵化后的前三天食物，具有免疫调节、抗菌、抗炎、抗肿瘤、调节血压、降低血糖和促进细胞生长等功能。研究发现，蜂王浆对包括阿尔茨海默病在内的神经性疾病有良好的改善作用，蜂王浆中的某些物质具有提高神经系统的传递功能、增强对大脑的营养功能、增加特定神经营养因子的表达量、促进大脑细胞的神经生长、促进大脑中神经干细胞向神经元、星状细胞和胶质细胞的分化，改善小鼠的认知功能障碍，提高大鼠的学习记忆指数等作用。因此，蜂王浆能够成为改善阿尔茨海默病等神经性障碍疾病的发生和发展的潜在药物来源。我国是世界上最大的蜂王浆生产国，产量占世界的90%以上，但其多以原料性的产品出口，缺乏深加工产品，从而导致产品价格较低，所获利润较少，因此，对蜂王浆进行深加工，可以有效提高我国蜂王浆的品质，增加出口创汇。新鲜蜂王浆含有多种生物活性物质，但贮存不当极易发生腐烂变质，失去原有的生物活性和营养价值。研究表明，蜂王浆的变质主要是其所含的蛋白质发生变化，从而导致一系列的化学反应促使其变质，因此蜂王浆中的蛋白质对蜂王浆发挥整体功效起着极其关键的作用。蜂王浆中所含的蛋白质对温度十分敏感，在贮存过程中部分蛋白质易发生降解， 并且在不同的温度条件下，不同蛋白质的降解速率不一样。贮存温度越高、时间越长，蜂王浆越容易发生美拉德反应(Maillard reaction)，变性速率越快。目前有研究发现，在蜂王浆的保健功效中起着举足轻重作用的水溶性蛋白质，降解产物会发生聚合，从而使水不溶性蛋白增加。研究者发现，通过酶水解得到的蜂王浆多肽不但存储要求降低，而且酶解后的蛋白质具有不易变质，更利于体内的代谢吸收，所含成分具有更理想的药理功能，更有助于阐明蜂王浆的作用机制。但迄今为止，对蜂王浆酶解后多肽的研究较少，且酶解的方法大多数通过胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等外源酶来进行，不适合蜂王浆蛋白的水解，较难筛选得到对人体真正有效的生物活性多肽。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术 提供一种蜂王浆多肽及其用途。该蜂王浆多肽通过从蜂王幼虫体内提取肠道酶，模拟蜂王体内酶解环境对蜂王浆进行酶解，得到的蜂王浆多肽生物活性更好，能够用于制备A β抑制剂。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案一种蜂王浆多肽，其由以下方法制备步骤1:将2 3日龄的蜂王幼虫，用0.9%的生理盐水洗涤后，取出所述蜂王幼虫的肠道，加入PH值为7. 0 7. 2的磷酸盐缓冲溶液或Tris-HCl缓冲溶液研磨成勻浆， 在18000 25000g，4°C条件下离心20 30min，收集第一次离心后的中层液体，然后在 18000 25000g，4°C条件下离心20 30min，收集第二次离心后的中层液体，得到肠道酶液；步骤2 在蜂王浆中，加入pH值为7. 0 7. 2的磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲溶液，在18000 25000g，4°C条件下离心20 30min，(除去不溶性成分)收集上清液，经截留分子量为8000 14000的透析袋在pH值为7. 0 7. 2的磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲溶液中冰浴透析42 72h，(每隔12h更换一次透析液)收集透析袋中透析液，得到水溶性蜂王浆蛋白液；步骤3 以mg/mL计，将步骤1所得的肠道酶液与步骤2所得的水溶性蜂王浆蛋白液按照蛋白浓度比为30 35 80 90混合，在pH值为8. 3 8. 7，温度为34 39°C的条件下酶解22 26h，得到水溶性蜂王浆蛋白酶解液；步骤4:将步骤3所述的水溶性蜂王浆蛋白酶解液冰浴停止酶解反应后，在 8000 15000g，4°C条件下离心10 20min，收集上清液，用10 μ m微孔滤膜过滤后，收集滤液得到第一滤液，将所述第一滤液经5kDa的超滤膜过滤，收集滤液得到第二滤液，将所述第二滤液经3kDa的超滤膜过滤，收集截留物得到3 5kDa的蜂王浆多肽。作为优选，其制备方法步骤1或步骤2中磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲溶液的浓度为 50mmol/L。作为优选，其制备方法步骤1中所述蜂王幼虫的肠道与磷酸盐缓冲液或Tris-HCl 缓冲溶液的质量体积比以g/mL计为1 1 1 2。作为优选，其制备方法步骤1中，勻浆或第一悬浮液的中层液体在20000g的条件下离心。作为优选，其制备方法步骤1中，勻浆或第一悬浮液的中层液体离心20min。作为优选，其制备方法步骤2中磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲溶液与所述蜂王浆的体积比为2 1 4 1。作为优选，其制备方法步骤2中，离心力在20000g的条件下离心20min。作为优选，其制备方法步骤2中，透析时间为48h。作为优选，以mg/mL计，其制备方法步骤3中，所述肠道酶液与所述水溶性蜂王浆蛋白液的蛋白浓度比为32. 5 85。 优选地，其制备方法步骤3中，所述肠道酶液的蛋白浓度为20 35mg/mL，所述水溶性蜂王浆蛋白液的蛋白浓度为25 45mg/mL，所述肠道酶液和所述水溶性蜂王浆蛋白液的质量比为1 2. 3 3.0。作为优选，其制备方法步骤3中酶解温度为37°C。作为优选，其制备方法步骤3中酶解pH值为8. 5。作为优选，其制备方法步骤3中酶解时间为24h。作为优选，其制备方法步骤4中，离心条件为在10000g，4°C条件下离心lOmin。本专利技术还提供了上述蜂王浆多肽在制备Aβ抑制剂中的应用。本专利技术还提供了上述蜂王浆多肽在制备预防和治疗阿尔茨海默病药物中的应用。本专利技术提供一种蜂王浆多肽及其用途。该蜂王浆多肽通过从蜂王幼虫体内提取肠道酶对蜂王浆本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种蜂王浆多肽，其特征在于，其由以下方法制备：步骤１：将２～３日龄的蜂王幼虫肠道，加入ｐＨ值为７．０～７．２的磷酸盐缓冲溶液或Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲溶液研磨成匀浆，在１８０００～２５０００ｇ，４℃条件下离心２０～３０ｍｉｎ，收集第一次离心后的中层液体，然后在１８０００～２５０００ｇ，４℃条件下离心２０～３０ｍｉｎ，收集第二次离心后的中层液体，得到肠道酶液；步骤２：在蜂王浆中，加入ｐＨ值为７．０～７．２的磷酸盐缓冲液或Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲溶液，在１８０００～２５０００ｇ，４℃条件下离心２０～３０ｍｉｎ，收集上清液，经截留分子量为８０００～１４０００的透析袋在ｐＨ值为７．０～７．２的磷酸盐缓冲液或Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲溶液中冰浴透析４２～７２ｈ，收集透析袋中透析液，得到水溶性蜂王浆蛋白液；步骤３：以ｍｇ／ｍＬ计，将步骤１所得的肠道酶液与步骤２所得的水溶性蜂王浆蛋白液按照蛋白浓度比为３０～３５∶８０～９０混合，在ｐＨ值为８．３～８．７，温度为３４～３９℃的条件下酶解２２～２６ｈ，得到水溶性蜂王浆蛋白酶解液；步骤４：将步骤３所述的水溶性蜂王浆蛋白酶解液冰浴停止酶解反应，然后在８０００～１５０００ｇ，４℃条件下离心１０～２０ｍｉｎ，收集上清液，用１０μｍ微孔滤膜过滤后，收集滤液得到第一滤液，将所述第一滤液经５ｋＤａ的超滤膜过滤，收集滤液得到第二滤液，将所述第二滤液经３ｋＤａ的超滤膜过滤，收集截留物得到３～５ｋＤａ的蜂王浆多肽。...

【技术特征摘要】
1.一种蜂王浆多肽，其特征在于，其由以下方法制备步骤1 将2 3日龄的蜂王幼虫肠道，加入PH值为7. O 7. 2的磷酸盐缓冲溶液或 Tris-HCl缓冲溶液研磨成勻浆，在18000 25000g，4°C条件下离心20 30min，收集第一次离心后的中层液体，然后在18000 25000g，4°C条件下离心20 30min，收集第二次离心后的中层液体，得到肠道酶液；步骤2 在蜂王浆中，加入pH值为7. 0 7. 2的磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲溶液，在 18000 25000g，4°C条件下离心20 30min，收集上清液，经截留分子量为8000 14000的透析袋在PH值为7. 0 7. 2的磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲溶液中冰浴透析42 72h， 收集透析袋中透析液，得到水溶性蜂王浆蛋白液；步骤3 以mg/mL计，将步骤1所得的肠道酶液与步骤2所得的水溶性蜂王浆蛋白液按照蛋白浓度比为30 35 80 90混合，在pH值为8. 3 8. 7，温度为34 39°C的条件下酶解22 26h，得到水溶性蜂王浆蛋白酶解液；步骤4 将步骤3所述的水溶性蜂王浆蛋白酶解液冰浴停止酶解反应，然后在8000 15000g，4°C条件下离心10 20min，收集上清液，用10 μ m微孔滤膜过滤后，收集滤液得到第一滤液，将所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯成强，孙平，颜慧，李虎臣，
申请(专利权)人：北京师范大学，北京师大科技园科技发展有限责任公司，
类型：发明
国别省市：11