一种白腐菌复合发酵生产漆酶的方法技术

本发明专利技术公开了一种白腐菌复合发酵生产漆酶的方法，向培养液中接入活化后的组合菌，于25～30℃条件下发酵培养9～12天；其中，所述的组合菌由射脉侧菌、污叉丝孔菌和虫拟蜡菌中的至少两种组成；所述的培养液由基础液体培养基和农作物秸秆粉组成，农作物秸秆粉为玉米杆粉、玉米棒粉、小麦杆粉或稻草杆粉中的至少一种。采用本方法，以玉米棒粉为原料，射脉侧菌和污叉丝孔菌组合协同发酵在第12天产漆酶酶活稳定达到110～120U/mL。本发明专利技术方法采用液体发酵，取材广泛，工艺简单；无需芳香化合物或重金属离子诱导等，条件温和；产漆酶活性高，稳定性好，是一种安全、环保、成本低廉、产品高效稳定，且极具工业化前景的生产方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种新的用于协同高产漆酶的白腐菌复合发酵的培养方法，并分别利用不同农作物秸秆为发酵底物，包括玉米杆、玉米棒、小麦杆和稻草杆，属于生物工程和微生物发酵领域。
技术介绍
漆酶(Laccase，Ε. C. 1. 10. 3. 2)是一类含铜的多酚氧化酶，最早是从漆树的汁液中发现的，后来发现其还广泛存在于真菌中，尤其在白腐菌中产量丰富，而白腐菌被认为是唯一能够降解全部木质成分的生物体。漆酶利用分子氧作为最终电子受体，能够广泛地氧化多酚、甲氧基苯酚、二元胺和其他酚类及芳香类化合物，可以将酚类物质氧化成醌类，并能催化芳香环支链C α -C β键的断裂，还可催化金属有机化合物氧化，以及催化底物氧化聚合或交联。由于漆酶作用底物广泛，催化活性高，因而广泛应用于造纸、生物修复、生物检测和食品工业等领域。在造纸工业中，漆酶可在常温常压条件下选择性地降解木质素而不影响纤维素和半纤维素，提高纸浆得率并且有效降低成本；经漆酶处理的纸浆制得的纸张具有良好的抗张强度和平滑度；造纸废水中的有机氯化物等毒性物质也可由漆酶降解，利于减少环境污染。由于漆酶可降解环境中的多种有毒物质，因此可以用于染料脱色并对污染的局部环境进行生物修复。此外，漆酶在催化过程中消耗氧气，使得这一过程很容易地被转化为电信号而高灵敏地得到检测，因此可用于制备生物传感器进行生物检测。在食品工业中，啤酒、果汁等饮料在储存期间往往出现浑浊或沉淀，这与其中含有酚或芳胺类物质有关。用漆酶预先处理麦芽汁，使其中的酚氧化后除去，则可提高啤酒的质量和透明度。经固定化漆酶处理的葡萄汁和葡萄酒，除去其中的酚类物质，能长期储存并保持澄清。目前，漆酶主要从真菌中获得，真菌漆酶是通过丝状真菌菌丝分泌到培养基中的， 其中漆酶分泌表达量最高的是白腐菌。白腐菌被认为是目前最活跃的木质素降解有机体， 能够解聚甚至矿化所有木质成分(主要是纤维素、半纤维素和木质素)，具有显著降解有色、芳香、异质性且顽固的在植物细胞壁中自然合成的木质素类苯丙单位。很多白腐菌都有较高的漆酶表达，因而是一种较为理想的漆酶来源。由于漆酶具有广阔的应用前景，因此找到一种能够以较低成本大规模生产漆酶的方法是当前推广漆酶应用的最大瓶颈之一。目前国内关于漆酶工业化生产的报道很少，漆酶的生产还处于理论探索和试验阶段。而且当前漆酶的发酵培养方法主要仅限于单菌的液体或固体发酵培养，研究也主要是针对单菌的液体或固体发酵培养的培养基、发酵条件等进行优化，尚未出现特别突出可以工业化生产的产酶效果。自然界中存在很多微生物降解群落，其中各种微生物之间既有协同作用，也有拮抗作用。彼此协同的微生物，能够通过各种代谢产生许多降解酶类或氧化还原类物质，共同降解环境中的动植物残体、垃圾等，可以说很多微生物降解群落本身就是一个高效的降解系统。如果能够选择两种或两种以上具有协同作用的菌株进行组合发酵，利用各种农作物残体，如农作物秸秆等，来进行漆酶的生产，不仅能很好地利用农作物秸秆等废弃物，减少农作物秸秆燃烧带来的环境问题，而且生产成本低廉、附加值高，是一种极具潜力的生产方法。
技术实现思路
本专利技术提供了，以农作物秸秆为发酵底物， 利用白腐菌属的组合菌通过微生物发酵法生产漆酶，工艺简单，条件温和，产漆酶效率高。—种白腐菌复合发酵生产漆酶的方法，包括向培养液中接入活化后的组合菌，于25 30°C条件下发酵培养9 12天。所述的组合菌由白腐菌属的射脉侧菌、污叉丝孔菌和虫拟蜡菌中的至少两种组成。所述的射脉侧菌(Phlebia radiate, PR DSM 5111)和污叉丝孔菌(Dichomitus squalens, DS DSM 9615)均购自 Deutsche Sammulung von Microorganismen und Zellkulturen(DSMZ)；虫拟蜡菌(Ceriporiopsis subvermispora, CS ACCC 31513)购自中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)。白腐菌是目前最活跃的木质素降解有机体，能够分泌胞外氧化酶降解木质素，是一种较为理想的漆酶来源。优选地，所述的组合菌由射脉侧菌和污叉丝孔菌组成，因为这两株菌株组合发酵农作物秸秆时，菌株之间的协同作用最强，使组合菌能更充分地利用农作物秸秆从而获得更高酶活的漆酶。所述的菌株的活化过程包括以灭过菌的马铃薯葡萄糖琼脂平板为活化培养基， 选择相同厚度的马铃薯葡萄糖琼脂平板，分别接入射脉侧菌、污叉丝孔菌和虫拟蜡菌，在 25 条件下活化培养5 7天。优选地，菌株接入马铃薯葡萄糖琼脂平板后，在条件下活化培养7天，待菌丝体长满平板备用。所述的培养液由基础液体培养基和农作物秸秆粉组成，所述的农作物秸秆粉为玉米杆粉、玉米棒粉、小麦杆粉和稻草杆粉中的至少一种。其中，所述的基础液体培养基包括以下组分葡萄糖 0. 1 1. Og，蛋白胨 0. 03 0. 3g，KH2PO4O. 01 0. lg, ZnSO4O. 00001 0. OOlgjK2HPO4O. 01 0. lg，FeSO4O. 00001 0. OOOlgjMnSO4O. 001 0. OlgjMgSO4O. 001 0. Ig和水lOOOmL，基础液体培养基的pH值为5. 5 6. 5 ；所述的农作物秸秆粉的粒径为 40 100目；所述的培养液中农作物秸秆粉的质量百分比浓度为1 10%。优选地，所述的农作物秸秆粉为玉米棒粉。在所述的发酵培养条件下，白腐菌属的组合菌能更好地利用玉米棒粉生产漆酶。所述的培养液中组合菌的接种方式为选择射脉侧菌、污叉丝孔菌和虫拟蜡菌中的两株菌接入相同厚度马铃薯葡萄糖琼脂平板活化至菌丝体长满平板后，分别挑取IcmXlcm 的菌丝块各1 5块接入培养液。所述的培养液接种后于25 30°C条件下发酵培养9 12天，优选地，所述的培养液接种后于条件下发酵培养12天。在此发酵培养条件下，组合菌降解农作物秸秆产漆酶活性最高，且漆酶稳定性最好。所述的培养液置于旋转式摇床中发酵培养，摇床转速为50 200rpm，优选 140rpm，便于发酵过程中菌株和农作物秸秆之间充分接触，确保发酵反应的充分进行。本专利技术方法，选择发酵培养过程中不同的时间点，分别取72h、144h、21Mi和288h， 对各样品的发酵培养液进行取样，采用2，2’_联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐法(ABTS法)测定样品中漆酶的酶活，具体为取0. IM pH 5. 0的醋酸钠缓冲液0. 5mL 和1. OmM的ABTS 0. 4mL,混勻，加入ImL发酵酶液启动反应，采用紫外-可见分光光度计在 420nm处测定^iin内吸光度的变化，每分钟使1 μ moL 2，2’ -联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)氧化所需要的酶量定义为一个酶活单位。本专利技术方法选择射脉侧菌、污叉丝孔菌和虫拟蜡菌这三种菌株进行两两组合，以农作物秸秆为原料进行协同液体发酵，取得了较理想的产酶效果，尤其是射脉侧菌和污叉丝孔菌的组合菌，产漆酶酶活不仅明显高于本专利技术所选菌株单菌所产漆酶的酶活，而且优于很多已报道的其它产漆酶的方法，且表现出较稳定的高酶活特性。本专利技术方法采用液体发酵，取材广泛，工艺简单，便于控制本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种白腐菌复合发酵生产漆酶的方法，包括：向培养液中接入活化后的组合菌，于２５～３０条件下发酵培养９～１２天；其中，所述的组合菌由射脉侧菌（Ｐｈｌｅｂｉａ　ｒａｄｉａｔｅ）、污叉丝孔菌（Ｄｉｃｈｏｍｉｔｕｓ　ｓｑｕａｌｅｎｓ）和虫拟蜡菌（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ　ｓｕｂｖｅｒｍｉｓｐｏｒａ）中的至少两种组成；所述的培养液由基础液体培养基和农作物秸秆粉组成，所述的农作物秸秆粉为玉米杆粉、玉米棒粉、小麦杆粉和稻草杆粉中的至少一种。

【技术特征摘要】
1.一种白腐菌复合发酵生产漆酶的方法，包括向培养液中接入活化后的组合菌，于25 30条件下发酵培养9 12天； 其中，所述的组合菌由射脉侧菌(Phlebia radiate)、污叉丝孔菌(Dichomitus squalens)禾口虫拟赌菌(Ceriporiopsis subvermispora)中的至少两种组成；所述的培养液由基础液体培养基和农作物秸秆粉组成，所述的农作物秸秆粉为玉米杆粉、玉米棒粉、小麦杆粉和稻草杆粉中的至少一种。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的组合菌由射脉侧菌和污叉丝孔菌组成。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的基础液体培养基由以下组分构成 葡萄糖 0. 1 1. Og,蛋白胨 0. 03 0. 3g, KH2PO4O. 01 0. lg, Zn...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈启和，董亚晨，何国庆，傅明亮，冯宇，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86