本发明专利技术提供了一种用于处理油脂污染物的脂肪酶、编码基因及其在微生物法水解处理油脂污染物中的应用，该脂肪酶及其编码基因序列如SEQ?ID?NO：1和SEQ?ID?NO：2所示。本发明专利技术提供的新的脂肪酶基因，能够在酵母菌中高效表达，克服了传统纯培养技术的不足，可提高脂肪酶的表达活力，对于促进脂肪酶在含油脂废水处理中的应用具有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种用于处理油脂污染物的脂肪酶、编码基因及其在微生物法水解处理油脂污染物中的应用。
技术介绍
近年来，环境中油脂类物质造成的污染日益严重，已成为一个亟待解决的环境问题。含油废水是一种量大而面广的污染源。随着人们生活质量的提高和环保意识的增强， 油脂的污染问题越来越受到人们的关注。目前油脂污染物常用的处理方法主要有物理法和化学法，但无法彻底消除废水中的油脂，而且易造成二次污染。生物法是处理油脂污染物的一种最有效、最安全和最彻底的方法。脂肪酶(Lipase，甘油酯水解酶)是一种特殊的水解酶，能够水解非水溶性酯类物质，如长链三酸甘油酯(脂肪)。脂肪酶的一个最显著的特点是它能特异性地在油-水两相界面上将脂肪水解为脂肪酸和甘油。近年来，对于脂肪酶的分子生物学研究在不断深入，到目前为止已克隆了很多脂肪酶基因，测定了它们的核苷酸序列，部分脂肪酶的蛋白晶体结构也已经研究清楚 (Winkler F K, Arcy AD et al. 1990 ；Brady L，1991)。大量文献报道了利用大肠杆菌(Escherichia coli)和毕赤酵母(Pichia Piastoris)等表达体系表达脂肪酶基因，Brocca等合成了全长为1647个碱基的经过密码子优化的Iipl基因，实现了其在毕赤酵母(Pichia pastoris)中的异源高效表达，产酶量高达 150U/ml (Brocca S, et al. 1998)。Pfeffer 等在 Escherichia coli Origami B 中采用一系列优化策略表达 Candidaantarctica 脂肪酶 A(CalA) (Pfeffer J, et al. 2007)。从自然界中筛选到的产脂肪酶野生菌，其脂肪酶基因一般受宿主菌的严谨调控， 表达的脂肪酶满足自身的代谢即可；而市场导向要求高效表达以提高脂肪酶产量。大量微生物脂肪酶基因的克隆与重组表达为市场需求提供了可保障的酶源，但是原有脂肪酶基因的表达效率仍然不高，是脂肪酶大量应用的一个瓶颈。目前能够在实验室纯培养的微生物仅占其总数的不到1%，绝大多数微生物不可培养，无法通过分离纯化的传统培养方式得到纯菌落，从而限制了新的脂肪酶基因的开发。 利用分子生物学的方法筛选新的脂肪酶基因，提高脂肪酶的表达活力，对于促进脂肪酶在含油脂废水处理中的应用具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术提供了一种从环境中筛选出的新的脂肪酶基因，该基因能够在酵母细胞中高效表达，克服了原有脂肪酶基因表达效率不高的缺陷。一种用于处理油脂污染物的脂肪酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示。本专利技术还涉及编码权利要求1所述脂肪酶的基因。具体的，所述基因核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。本专利技术通过构建活性污泥的DNA文库，筛选到一个新的高效表达的脂肪酶基因。克服了传统纯培养技术的不足，是一条寻找新的脂肪酶基因的新途径。本专利技术涉及的脂肪酶基因，是一种新的基因，与同类基因没有同源性。其编码的脂肪酶是一种新的脂肪酶，与其他已报道的脂肪酶氨基酸序列相比，相似性小于30%。应当指出的是，对本专利技术的脂肪酶基因所编码的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸替换、插入或缺失所得到的功能类似物均属于本专利技术的保护范围。在已知本专利技术脂肪酶基因的情况下， 本专利技术普通技术人员可按本领域常规方法构建载体、转化、表达，获得所述脂肪酶。本专利技术还涉及含有所述基因的重组载体，将含有所述基因的重组载体转化至宿主菌(通常为酵母菌)中，进行表达，即可获得本专利技术脂肪酶。本专利技术还涉及所述基因在制备重组脂肪酶中的应用。本专利技术还涉及所述的脂肪酶在微生物法水解处理油脂污染物中的应用。本专利技术的脂肪酶的最适温度是25 ;35°C，最适pH为6. 5 7. 5。本专利技术的有益效果主要体现在本专利技术提供了一种新的脂肪酶基因，能够在酵母菌中高效表达，克服了传统纯培养技术的不足，可提高脂肪酶的表达活力，对于促进脂肪酶在含油脂废水处理中的应用具有重要意义。附图说明图1为活性污泥总DNA电泳图谱；图2为Sau3A I酶切DNA电泳图谱；图3为重组质粒pPIC9K_lipN的EcoR I/Not I双酶切验证电泳图谱；图4为转化酵母中IipN目的基因的PCR验证电泳图谱；M =Marker, A 以5’ AOXl 和3’ AOXl作为引物扩增，B 以α -factor和3’ AOXl作为引物扩增图5为脂肪酶的最适pH曲线；图6为脂肪酶的最适温度曲线。具体实施例方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此实施例1 活性污泥DNA文库的构建1、活性污泥DNA的提取从某食品污水处理厂采集污泥，经过适当稀释作为样品进行DNA的提取。 12000r ^irT1离心5min收集样品，TE重悬洗涤一次后，加溶菌酶至终浓度为100 μ g -πιΓ1, 37°C水浴2小时。加5Μ NaCl调整终浓度至0. 5Μ，混勻后加入40 μ 1蛋白酶K和20 % SDS (终浓度为0. 5 1 % )，37°C过夜或者50°C水浴池至溶液粘稠澄清。加1/3体积的饱和NaCl 剧烈振荡1 后，12000r · HiirT1离心5min，收集上清至一灭菌离心管中，加入0. 6V异丙醇混勻后沉淀，12000r · HiirT1离心收集沉淀，用70%乙醇洗涤，吹干后溶于400 μ 1灭菌去离子水中，总DNA电泳如图1所示。2、DNA文库的构建(I)DNA 的酶切用Sau3A I部分酶切活性污泥总DNA，先用检测型反应体系进行酶切，确定最适酶切浓度及时间，最终进行制备型部分酶切。检测型酶切反应体系(IOyL)总DNA 2yL, Sau3AI适量，缓冲液1 μ L，加ddH20至终体积10 μ L。制备型酶切反应体系(100 μ L)总 DNA20 μ L，Sau3AI适量，缓冲液10 μ L，加ddH20至终体积100 μ L。其中所加Sau3AI酶量根据酶切浓度及时间进行摸索，切胶回收2 41Λ条带的DNA片段，作为外源片段，电泳如图 2所示。(2)脱磷载体的制备提取pucl8质粒，用BamHI进行单酶切，回收1. Skb大小的线性片段进行去磷酸化反应。在微量离心管中建立以下的反应体系线性化PUC18载体^ul，10X碱性磷酸酯酶缓冲液 5 μ 1，CIAP (16U/μ 1 TAKARA) 0. 5ul，加 ddH20 至终体积 50 μ 1。50°C反应 30min，加 1/10体积0. 5M的EDTA终止反应；合并四管用ddH20补足至500ul ；加400ul酚/氯仿抽提 1次，吸出上清；加1/10V的3M NaAc, 2V预冷的乙醇，在_20度沉淀60min ；离心收集沉淀， 用200 μ 1 70%乙醇洗涤后吹干，用20 μ ITE溶解。电泳定量，50 IOOng/管分装保存于终浓度为50%的灭菌甘油中，备用。(3)转化将外源片段和载体按比例进行过夜酶连。取E. coli DH5a高效感受态细胞(每管约200μ 1)于冰浴中融化，每管加2μ 1酶连产物，轻轻旋转以混勻内容物，冰浴中放置 30min,将离心管放入42°C的循环水浴中，热激90s，不要摇动离心管。快速将离心管移到冰浴中使细胞冷却1本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种用于处理油脂污染物的脂肪酶，其氨基酸序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１所示。
【技术特征摘要】
1.一种用于处理油脂污染物的脂肪酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示。2.编码权利要求1所述脂肪酶的基因。3.如权利要求2所述的编码基因，其特征在于所述基因核苷酸序列如SEQID N0:2所示。4.含有权利要求2所...
【专利技术属性】
技术研发人员：郑展望，杨瑾，
申请(专利权)人：浙江商达环保有限公司，
类型：发明
国别省市：86
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