本发明专利技术公开了一种载有人胰岛素样生长因子-Ⅰ基因的重组转基因载体，所述重组转基因载体包括：外源基因人胰岛素样生长因子-Ⅰ、启动子、增强子元件；构建所述重组转基因载体的转座子为piggyBAC转座子；所述启动子为丝素重链蛋白启动子；所述重组转基因载体还包括：丝素重链蛋白启动子下游信号肽相应的DNA序列、家蚕丝素轻链fib-LpolyA信号位点的序列。应用该重组转基因载体制备得到生产IGF-Ⅰ的转基因家蚕，可以提高IGF-Ⅰ的表达水平，并且避免外源基因和杆状病毒的不安全性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种能表达人胰岛素样生长因子-1的重组转基因载体，以及利用转基因家蚕丝腺生物工厂表达人胰岛素样生长因子-1的方法。
技术介绍
人胰岛素样生长因子-1 (IGF-1)是一种受GH调节的单链多肽，由70个氨基酸组成，分子量为7 649 Da，其结构有45%与胰岛素相似。IGF-1有种系稳定性，所有哺乳类动物的IGF-1结构及组成基本相同。IGF-1具有多种生理功能，有促生长、促物质代谢、促细胞分裂增殖等作用。临床上可用于糖尿病、胰岛素抵抗、肥胖症、分解代谢亢进性疾病、株儒症、肾功能不全和神经系统疾病等治疗。目前，对于IGF-1的基因药物的开发研究，主要采用大肠杆菌表达系统或者酵母菌表达系统或昆虫细胞表达系统或人工提取(参见:吴岚晓，李明，王萍，陈白虹，人胰岛素样生长因子-1在大肠杆菌中的表达，药物生物技术，2001，4:8-11 ; Fischer B， Sumner Lj Goodenough P， et al; Isolation,renaturation and formationof disulfide bonds of eukaryotic proteins expressed in Escherichia coli asinclusion bodies ;Biotechnology and Bioengineering; 1993 年；赖心田，周鹏，洪葵；人胰岛素样生长因子I在毕赤氏酵母中的表达研究，药物生物技术；2002年03期；赵红，汪承亚，昆虫细胞表达重组人胰岛素样生长因子I的研究，南京医科大学学报-2000，20 (4)243-245)ο上述方法各有特点:(I)酵母菌表达系统，表达量低，且存在酵母特异的碳水化合物分枝；而大肠杆菌表达系统对表达产物无 后加工修饰作用，表达产物的天然性差，工艺复杂，成本高；一般的昆虫细胞表达系统产物可能有杆状病毒的污染，大规模培养昆虫细胞的工艺还不成熟，且培养成本高；(2)人工提取法:公开号为CN1603344、CN1757650的中国专利申请公布说明书公开了一种从鲜鹿茸提取胰岛素样生长因子(IGF-1)的方法，该方法的受到鲜鹿茸资源的限制；(3)公开号为CN1384201的中国专利申请公布说明书公开了一种利用重组杆状病毒在昆虫体内特别在家蚕内表达、生产重组人类胰岛素生长因子一 I (IGF — I)，并用所生产的人类胰岛素生长因子制备口服降血糖的方法，该方法需构建带有IGF -1基因的重组杆状病毒，将该重组病毒通过人工接种方式感染家蚕从而实现IGF -1的表达。这种方式可以制备口服药物，但其工艺复杂，重组病毒需要通过人工皮下接种方式感染家蚕，处理工作量大，同时，获得的产物中存在残留重组杆状病毒的可能性，具有难以预测的风险性；(4)公开号为CN101023778的中国专利申请公布说明书公开了一种制备富含IGF-1的柞蚕粉，并作为仔猪饲料添加剂的方法。公开号为CN101270367的中国专利申请公布说明书公开了一种家蚕丝腺生物工厂的建立方法，并用转基因丝腺冻干粉制作口服降糖药物的方法，但选用丝蛋白启动子不带有信号肽相应的DNA序列，外源基因在丝腺组织中的表达水平较低，用丝腺组织制成的冻干粉含有外源重组DNA的污染，具有难以预测的风险性。因此，需要研发一种能提高外源基因IGF -1在家蚕丝腺中表达量的方法，同时能较少其他外源重组基因的污染，避免杆状病毒带来危险，提高安全性。
技术实现思路
本专利技术的专利技术目的是提供一种能表达人胰岛素样生长因子-1的重组转基因载体。为达到上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案是:一种载有人胰岛素样生长因子-1基因的重组转基因载体，所述重组转基因载体包括:外源基因人胰岛素样生长因子-1 (IGF-1)、启动子、增强子元件；其特征在于:构建所述重组转基因载体的转座子为piggyBAC转座子；所述启动子为丝素重链/从-H蛋白启动子，并且该启动子带有下游信号肽相应的DNA序列；所述的增强子为丝素轻链/i6-L基因第I内含子的部分序列；重组转基因载体还包括:丝素重链蛋白启动子下游信号肽相应的DNA序列、家蚕丝素轻链/^-LpolyA信号位点的序列。上述技术方案中，所述重组转基因载体还包括:新霉素抗性基因。上述技术方案中, 所述piggyBAC转座子载体优选为pigA3GFP转座子载体,因为所述pigA3GFP转座子载体带有荧光蛋白报告基因，方便筛选。上述技术方案中，所述载有人胰岛素样生长因子-1基因的重组转基因载体的制备方法为:通过基因工程操作将家蚕丝素重链蛋白启动子及其下游信号肽相应的DNA序列控制的人类胰岛素生长因子-1基因的表达盒、增强子元件和新霉素抗性基因表达盒克隆进piggyBAC转座子载体pigA3GFP构建重组转基因载体；具体包括以下步骤:(I)制备 I 基因；(2)将IGF-1基因克隆进过渡空质粒，制备载有IGF-1基因的过渡载体A ；(3)制备丝素轻链基因的polyA信号序列，并克隆到过渡载体A中，得到过渡载体B ；(4)制备丝重链基因启动子及其下游信号肽相应的DNA序列Fib-HS，并克隆进过渡空质粒，制备得到载有Fib-HS基因的过渡载体C ；(5)以过渡载体B为模板，PCR扩增含有IGF-1基因和polyA信号序列的基因片段，然后克隆到过渡载体C中，得到过渡载体D ;(6) PCR扩增得到丝素轻链基因第I内含子中具有增强子功能的的序列，构建带有增强子元件的基于piggyBAC转座子的转基因载体pigA3GFP-en ；(7)酶切过渡载体D，回收丝素重链蛋白启动子及其下游信号肽相应的DNA序列控制IGF-1基因片段，克隆进同样酶切的pigA3GFP-en获pigA3GFP-en-，即得到带有增强子元件和丝素重链蛋白启动子及其下游信号肽相应的DNA序列控制IGF-1基因的转基因载体；(8)制备家蚕核型多角体病毒见-2基因启动子，克隆进过渡空质粒，制得含家蚕核型多角体病毒见-7基因启动子的过渡载体E ;制备Neo基因的编码序列及其下游的PolyA信号序列，双酶切后克隆进同样双酶切的过渡载体E，制得带有家蚕核型多角体病毒IE-1基因启动子控制新霉素抗性基因neo的重组载体，即过渡载体F ； (9)过渡载体F酶切后回收带有IE启动子控制新霉素抗性基因的片段IE-Neo，克隆进同样酶切的pigA3GFP-en-质粒，即制得有丝素重链蛋白启动子及其下游信号肽相应的DNA序列控制IGF-1基因表达盒、增强子元件、新霉素抗性基因和荧光蛋白报告基因的重组转基因载体，命名为pigA3-FibHS-1GF-en-ne0。上述技术方案中，步骤(I)制备I基因的方法为:根据公开的人胰岛素样生长因子-1基因的CDNA序列，按常规人工合成人胰岛素样生长因子-1活性肽对应的DNA序列；优选地的技术方案中，为了便于克隆表达，在5'端引入起始密码子ATG和EcoR V的酶切位点，3'端引入终止密码子TAA和沿ο 1、III的酶切位点；上述技术方案中，步骤(2)制备载有I基因的过渡载体A的方法为:将步骤⑴人工合成的I基因序列用V和通ο I双酶切，常规法回收酶切片段，与用 V和沿ο I双酶切的pBluescript II SK(+)质粒连本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种载有人胰岛素样生长因子－Ⅰ基因的重组转基因载体，所述重组转基因载体包括：外源基因人胰岛素样生长因子－Ⅰ、启动子、增强子元件；其特征在于：构建所述重组转基因载体的转座子为ｐｉｇｇｙＢＡＣ转座子；所述启动子为丝素重链ｆｉｂ－Ｈ蛋白启动子，并且该启动子带有下游信号肽相应的ＤＮＡ序列；所述的增强子为丝素轻链ｆｉｂ－Ｌ基因第１内含子的部分序列；重组转基因载体还包括：丝素重链蛋白启动子下游信号肽相应的ＤＮＡ序列、家蚕丝素轻链ｆｉｂ－ＬｐｏｌｙＡ信号位点的序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：贡成良，曹广力，薛仁宇，郑小坚，潘中华，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：32
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