本发明专利技术公开一种脂肪酶的高效生产方法，发酵阶段采用了两段式溶氧控制策略，实现脂肪酶的高效表达，降低后续提取的难度；分离提取阶段通过过料液循环与渗透液循环实现发酵与提取的偶联。应用本本发明专利技术使得酶不断被实时的分离和浓缩富集，减少了发酵罐中酶表达的同时被蛋白酶降解的程度，提取酶活得率可达85％以上，菌落总数小于10CFU/ml，大肠菌群小于3，酵母与霉菌小于10CFU/ml，致病菌(沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌)未检出。通过渗透液循环可大幅减少了用水量和废水产生量，节能减排。本方法实现了脂肪酶的高效清洁生产，具有广阔的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种脂肪酶的生产方法，是一种高密度发酵与高效分离耦合的清洁生产方法。
技术介绍
在脂肪酶下游提取分离上，实验室规模提取常用絮凝——离心处理，然后膜超滤进一步除菌，这种方法的酶活回收率较低，而且只适合小规模处理，不易于工业放大。工业大规模的脂肪酶提取常用板框压滤除菌(图1)，因为发酵液菌体浓度高，粘度较大，而且发酵液板框处理时间较长，且发酵液放罐后放置过程中，衰亡菌体数量不断增加、粘度不断增大，除菌难度很大，甚至无法进行。由于板框压滤过程中滤饼的可压缩性，使过滤阻力增大， 液体透过性差，工业上应用助滤剂来解决这个问题，菌体难以分离回收利用。板框设备系统昂贵，占用空间大，能耗高，手动操作，需要配备的工人多，用水量大，繁琐的滤布清洗、安装，废渣废水产生量大，且难以回收利用。板框压滤一般分为明滤、暗滤两种方式，暗滤方式难预防料液泄露，明滤的滤出液处于开放环境中，容易发生交叉污染，难以满足微生物限量要求严格的食品和医药级生物制品的生产要求。毕赤酵母重组菌的发酵目前的发酵方式为补料分批发酵，中后期菌体达到很高的密度、粘度很大。发酵、除菌、超滤浓缩操作单元离散化，产量的进一步提高存在着瓶颈效应，毕赤酵母诱导表达相较长，发酵中后期酶活达到了较高水平，但酶不断产生的过程中也同时存在着酶的不断降解和酶在发酵过程的稳定性问题。放罐后发酵液在预滤储罐待滤过程中，菌体处于缺氧和营养匮乏状态，菌体衰亡加速，发酵液则变得越来越粘稠，给下游处理带来了很大的困难。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种脂肪酶高效生产方法，包括耦合的脂肪酶高密度发酵表达与膜提取步骤，实现脂肪酶的高效表达、高效分离与高提取得率的清洁生产。具体步骤如下如图2所示。在甲醇诱导表达阶段，采用溶氧两段式控制策略，甲醇流加启动后，控制溶氧为初始溶氧值40% 50%，当菌体浓度达到100 110g/L后，适当限制溶氧于10 % 20 %，整个诱导表达过程中，甲醇浓度维持于0. 08 0. 12 %。从诱导相60 士 2h后开始进行发酵提取耦合，不断进行料液循环以及渗透液循环操作，持续约20 30h。陶瓷膜工艺参数膜截留分子量800kDa、膜操作压力0. 25MPa、温度20 28°C、湿菌体含量30% 40%，耦合启动时，先往陶瓷膜储罐中加约为原发酵液体积三分之一至五分之一的水，然后启动耦合陶瓷膜微滤、膜超滤等。超滤膜的工艺条件膜截留分子量10 30kDa、膜操作压力0. 5MPa、温度20 26°C、浓缩倍数以总蛋白质浓度为控制指标，约为 20 24g/L。所述发酵罐与陶瓷膜之间设置一个缓冲储罐用于控制料液的循环速度。脂肪酶酶活测定橄榄油法，参照中华人民共和国国家标准GB/T23535-2009。湿菌体含量测定料液固形物含量是陶瓷膜微滤工艺控制的一个重要指标，为了方便检测与调控，本专利技术以湿菌体含量为控制指标，即取IOml发酵液，6000rpm离心lOmin， 弃上清液，离心管倒置于滤纸上数分钟，称重，再折算成IOOml发酵液的菌体湿重，以重量体积百分比表示。膜通量测定用量筒测量滤出液，同时秒表计时，按以下公式计算膜通量J = V/St,式中J为膜通量(L/m2 · h)、V为透过液体积(L)、S为有效膜面积(m2)、 t为微滤时间(h)。通常以膜衰减曲线和膜拟稳态通量来评价过滤效果，微滤启动后，膜通量迅速衰减至某个值后在一段时间内维持拟稳定状态，这时的膜通量称为膜拟稳态通量。粘度利用NDJ-IB旋转粘度计进行测量。总蛋白浓度考马斯亮蓝法。微生物的检测根据中华人民共和国国家标准GB4789. 2-2010, GB4789. 3-2010、 GB4789. 15-2010检验菌落总数、大肠菌群数量、霉菌和酵母菌落数。致病菌(沙门氏菌、 志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌)则按照GB4789. 4-2010、GB/T4789. 5-2003、 GB4789. 10-2010、GB/T4789. 11-2003 标准进行检验。诱导阶段，溶氧分段控制，以100 110g/L菌体浓度为控制点，前阶段给予较高溶氧是为了让菌体尽快长至高密度，后阶段控制较低溶氧，并在较低溶氧的条件下优化得到最佳的其他工艺条件，既能使较高的产物比生成率维持较长的时间，也能使终菌体浓度控制于适当水平，改善发酵液的粘度，降低下游提取的难度，另外，较低的溶氧工艺条件，在工业生产上容易实现，使生产工艺容易放大到产业规模。陶瓷膜的应用弥补了板框的不足。陶瓷膜微滤是以压力差为推动力的分子筛膜分离过程，在生化制药、果汁饮料、乳制品、精细化工、污水处理、工业/民用/饮用水领域，得到了广泛的应用，在除菌方面也得到了广泛的推广。陶瓷膜可以除去几乎所有的微生物。升或吨级规模化的陶瓷膜微滤技术在毕赤酵母除菌中的应用还未见报道。本专利技术创新性地在诱导阶段采用了两段式溶氧控制策略，实现脂肪酶的高效表达，降低后续提取的难度，便于工业化放大；建立了发酵罐、陶瓷膜和超滤膜三者耦合的生产方式，工艺路线流程如图2所示，使得酶不断被实时的分离和浓缩富集，减少了发酵罐中酶表达的同时被蛋白酶降解的程度，提高了总产量。在发酵罐与陶瓷膜之间设置缓冲储罐， 易于控制料液的循环速度，也便于添加消泡剂，减少料液的气含量，避免陶瓷膜供料泵与内循环泵的空转或泵功率减弱，提高了料液也膜的有效接触面积和料液循环效率。渗透液循环减少了培养基成分的流失，维持发酵体系中水、培养基成分、微量元素含量等的稳定，也大幅减少了用水量和废水产生量，节能减排。另外，渗透液循环的同时不断回收流失的酶， 提高了提取得率。在发酵表达阶段连续流加甲醇，使得耦合系统中循环液也保持一定浓度的甲醇，利用甲醇对杂菌的抑制作用，保证了膜滤液的高度无菌状态。附图说明图1板框压滤工艺流程图；图2脂肪酶清洁生产工艺流程图。具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所 用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。生物材料的获得本专利技术以含有华根霉(Rhizopus chinensis)CCTCC No. M201021脂肪酶基因的重组酵母菌株GS115/pPIC9K-proRCL为生产菌株。生产菌株GS115/pPIC9K_proRCL已在 Xiao-ffei Yu, Le-Le Wang, Yan Xu. Rhizopus chinensis lipase :gene cloning, expression in Pichia pastoris and properties. (2009)Journal of Molecular Catalysis B =Enzymatic 57 304-311 中公开。实施例1脂肪酶的生产方法取菌种甘油保存管，吸200 μ m接到YPD培养基中，摇床30°C培养18小时左右，当种子液0D_达2 5后，完成摇瓶种子液的制备。然后转入5L发酵罐BSM基础盐培养基继续进行种子培养，当菌体湿重(DCW)达到23g/L左右，移种至50L发酵罐中进行培养，各级接种量皆为10%。50L罐发酵，起始装液量为18L，在30°C、pH5. 5、溶氧50% 80%条件下进行甘油生长相培养。当基础培养基本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种脂肪酶的高效生产方法，其特征在于将脂肪酶的高密度发酵生产与分离提取相耦合，所述提取步骤包括陶瓷膜微滤及超滤膜超滤。
【技术特征摘要】
1.一种脂肪酶的高效生产方法，其特征在于将脂肪酶的高密度发酵生产与分离提取相耦合，所述提取步骤包括陶瓷膜微滤及超滤膜超滤。2.权利要求1所述的方法，其特征在于所述高密度发酵生产采用溶氧两段式控制策略，具体为甲醇诱导相启动后，溶氧控制于40% 50%，菌体浓度DCW达到100 110g/L 后，溶氧控制于10% 20%。3.权利要求1所述的方法，其特征在于所述耦合通过料液循环与渗透液循环实现。4.权利要求3所述的方法，其特征在于所述料液循环与渗透液循的工艺条件为启动料液循环与渗透液循环后，当残料液酶活低于初始发酵液酶活的10% -20%时结束发酵， 撤去渗透液的循环，对发...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐岩，喻晓蔚，穆晓清，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：32
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