本发明专利技术提供了一种以SARS、TGEV、AIBV等冠状病毒主蛋白酶的体外抑制活性筛选和晶体结构为基础，从鄂西香茶菜中筛选二萜类天然产物抑制剂的方法。本发明专利技术具有下述结构通式的化合物能够有效抑制冠状病毒主蛋白酶的活性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及药物的筛选，更具体而言，涉及以SARS、TGEV、AIBV等冠状病毒主蛋白酶的体外抑制活性筛选和晶体结构为基础，从鄂西香茶菜中筛选二萜类天然产物抑制剂的方法。
技术介绍
SARS (Severe Acute Respiratory Sydrome)为引起严重急性呼吸道综合症(非典型性肺炎)的简称，其病原体为冠状病毒属的一种病毒(Peiris J. et al. Lancet, 2003, 361: 1319-1325)。冠状病毒是正链RNA病毒。冠状病毒属隶属于冠状病毒科。在目前已知的正链RNA病毒中，它们的基因组是最大的(Siddell，S.G.等人Coronaviruses， toroviruses, and arteriviruses. in Topley & Wilson, s Microbiology and Microbia Infections, IOth edition, Vol. Virology (eds. Mahy, B. W. J. & ter Meulen, V.) 823-856 (Hodder Arnold, London, 2005)。这个属含有约沈个种；按照它们的自然宿主、 基因序列以及血清型关系，这个属又可以分为三个组群其中第一组群包括TGEV，Porcine Transmissible Gastroenteritis Virus (猪传染性胃肠炎病毒)等；第二组群包括SARS冠状病毒等；第三组群包括AIBV，Avian Infectious Bronchitis Virus (禽传染性支气管炎病毒)等(Spaan, W. J. M. and Cavanagh, D. Coronaviridae. in Virus taxonomy, VIIIth Report of the ICTV. 945-62 (Elsevier-Academic Press., London, 2004)。SARS冠状病毒2/3到3/4的基因组编码了两个复制酶多蛋白(r印Iicase polyproteins) ppla禾口pplab (Ziebuhr, Snijder et al. 2000； Thiel, Herold et al. 2001; Anand, Yang et al. 2005; Ziebuhr 2005)，它们只有在病毒编码的蛋白酶切割成独立亚基之后才能使病毒完成正常转录、复制(Ziebuhr, Snijder et al. 2000; Anand, Yang et al. 2005; Bartlam, Yang et al. 2005)o SAI 冠状病毒主要蛋白Onain protease，简称主蛋白酶)在这个过程中起主要作用。如果能够抑制SARS冠状病毒主蛋白酶的水解作用，那么将会有效地抵御SARS冠状病毒对人体的侵染。因此，SARS冠状病毒的主蛋白酶是抗SARS药物筛选的一个主要靶标。天然产物又称次级代谢产物(Secondary Metabolites)，具有结构的多样性和生物活性的多样性。天然产物及其衍生物在以往的疾病治疗中发挥了无可限量的作用，也是当今药物研发过程中最具潜力的资源之一(Newman DJ, Gragg GM, Snader KM. Nat Prod R印，2000，17(3) :215-234; Lee K-H. J Nat Prod. 2004，67 O) : 273-283)。现在对中药等传统药物、海洋生物以及微生物代谢过程中的天然产物研究方兴未艾，每年都会有大量结构新颖的化合物被发现提供出来，这些新颖化合物是合成方法所无法实现的药物和药物先导化合物的重要源泉，在新药和先导化合物的发现中起着重要作用。对于天然产物尤其是来源于中药等的天然产物的研究是很有必要的，因为中药在我国已有数千年应用的历史，是一个小分子化合物的宝库，因此从中药等天然产物中进行重要病毒或重要疾病相关靶蛋白抑制剂的筛选是很有必要的。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种能够有效抑制冠状病毒主蛋白酶活性的中药小分子抑制剂。本专利技术的又一个目的是提供所述中药小分子抑制剂在制备用于治疗或者预防冠状病毒感染的药物中的用途。本专利技术的另一个目的是提供一种筛选冠状病毒主蛋白酶抑制剂的方法。本专利技术提供的一种筛选冠状病毒主蛋白酶抑制剂的方法包括如下步骤A、将冠状病毒主蛋白酶的晶体与备选样品接触浸泡，得到冠状病毒主蛋白酶与小分子抑制剂复合体的晶体。B、收集并分析步骤A中得到的复合体的晶体的X射线衍射数据，获得与冠状病毒主蛋白酶结合的小分子抑制剂的电子密度。C、以步骤B中获得的与冠状病毒的主蛋白酶结合的小分子抑制剂的电子密度为基础，鉴定与冠状病毒主蛋白酶结合的小分子抑制剂，获得小分子抑制剂与冠状病毒主蛋白酶复合体的精细三维结构。D、测定小分子抑制剂对冠状病毒主蛋白酶的抑制活性。本专利技术所用的备选样品，优选用如下方法制备(a)、取一定量的初级原料，用乙醇溶液回流提取，合并提取液，浓缩得浸膏；(b)、称取一定量步骤(a)中所得的浸膏，用双蒸水悬浮，用有机溶剂萃取，分离有机溶剂相和水相；合并水相，备用；合并每次有机溶剂萃取物，蒸除其中的有机溶剂，得到干膏状有机溶剂相样品，备用；(C)、蒸除步骤(b)中萃取后的水相部分的水中溶解的少量有机溶剂，用大孔树脂柱层析分离，依次用水和乙醇溶液为流动相洗脱；弃去水洗部分，蒸除乙醇溶液洗脱部分的溶剂，得干膏状样品备用；(d)、上述步骤(b)中制得的干膏状有机溶剂相样品和步骤(c)中制得的干膏状样品即为源自一种初级原料的2个备选样品。本专利技术中所用的初级原料优选为鄂西香茶菜。本专利技术的鄂西香茶菜各备选样品可采用如下方法制备取500克干燥粉碎的鄂西香茶菜药材，用4500毫升95%乙醇回流提取，提取3次，每次2小时，合并提取液，浓缩得浸膏。称取此浸膏20. 5克，用150毫升双蒸水悬浮，倾入1000毫升分液漏斗中，用乙酸乙酯萃取3次，每次萃取用乙酸乙酯650毫升，充分振摇，静置6-10小时分层。萃取后得到乙酸乙酯相和水相。乙酸乙酯萃取物用EYELA N1001型旋转蒸发仪蒸除溶剂，得干膏状鄂西香茶菜乙酸乙酯萃取样品，备用。萃取后的水相部分用EYELA N1001型旋转蒸发仪蒸除水中溶解的少量乙酸乙酯， 用HP-20型大孔树脂柱层析分离(大孔树脂用170毫升，玻璃柱规格30 X 300 mm)，依次用水、50%乙醇为流动相洗脱。先用水洗脱8次，每次洗脱250毫升，弃去水洗部分。然后用 50%乙醇洗脱5次，每次洗脱300毫升，合并各次50%乙醇洗脱得到的洗脱液。将50%乙醇洗脱部分使用EYELA N1001型旋转蒸发仪蒸除溶剂，得干膏状鄂西香茶菜水相大孔树脂 50%乙醇洗脱样品，备用。上述乙酸乙酯萃取样品和水相大孔树脂50%乙醇洗脱样品即为鄂西香茶菜对 SARS冠状病毒主蛋白酶体外抑制活性的备选样品。步骤B中晶体的X射线衍射数据收集与整理可采用如下方法首先使用Hampton Research公司的尼龙晶体环，从晶体浸泡液中获取浸泡一定时间 (浸泡时间控制在2 - 48小时之间)的晶体，并迅速使用Rigaku公司的冷却系统或Oxford C本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．鄂西香茶菜在制备治疗冠状病毒感染的药物中的用途。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：饶子和，娄智勇，孙玉娜，马明，张妍，郭宇，张畅，薛飞，
申请(专利权)人：清华大学，南开大学，中国科学院生物物理研究所，
类型：发明
国别省市：11
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