本发明专利技术涉及生物监测领域，具体涉及一种采用安培免疫传感器进行夹心免疫反应的二抗探针，其中所述的二抗探针由小牛胸腺DNA分子链和附着在小牛胸腺DNA分子链上的纳米球构成，其中所述的纳米球的表面为酶标记的抗体蛋白，内部为磁性纳米颗粒，该颗粒为在四氧化三铁纳米颗粒表面沉积一层无定形氧化锆形成。本发明专利技术所述的二抗探针适于采用安培免疫传感器进行夹心免疫反应测量抗原的浓度，且具有检测线性范围宽，检测极限低的优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物检测领域，特别是涉及分子识别的探针，该探针适于采用安培免疫传感器进行夹心免疫反应测量抗原的浓度。
技术介绍
1990年Henry等提出了免疫传感器的概念，免疫传感器利用抗原、抗体作为分子识别原件，把抗原-抗体特异性反应过程中产生的信号通过换能器转变成电信号，从而对被测物进行定量分析。与传统的检测技术相比较，具有高灵敏度、高特异性、操作简便、分析速度快、价格低廉等优势，且易于实现自动化操作，在临床诊断、医疗保健、环境监测、食品安全等领域显示出良好的应用前景。然而已报道的电化学安培传感器在使用中也存在以下不足①多采用“一步法”即采用抗原抗体结合后形成的免疫复合物导致电极表面电流下降，根据下降电流来进行定量，这样就不可避免的难以克服非特异性吸附的影响；②当电极表面的抗原/抗体发生免疫结合后生成物很难除去，电极无法更新，使用多为一次性；③尽管安培免疫传感器有诸多优点，但是面对背景非常复杂的具体检测对象(如血清样品)，往往需通过一定的样品提纯处理后再进行检测，影响了其易用性。所以，上述问题在一定程度上限制了免疫传感器的优势。近年来，基于夹心免疫的纳米修饰电化学传感器由于其卓越的灵敏度引起人们的广泛关注。由于夹心免疫传感器与“一步法”传感器相比具有较高的敏感性和特异性， 制备此类传感器最关键的就在于对二抗的富集。已经有报道采用多种纳米材料对二抗进行富集，如碳纳米球、二氧化硅、纳米Pt、二氧化锰、石墨烯(GS)、碳纳米管(CNTs)、纳米金 (nano-Au)、量子点等。然而这些富集过程繁琐，需要离心才能分离探针和未结合抗体；有研究使用磁性纳米材料(如四氧化三铁、金磁纳米颗粒)等富集抗体，避免了繁琐的离心过程，但是其合成的磁性材料容易团聚，稳定性差，且单个纳米颗粒对抗体的富集效果有限。 袁若等报道了通过抗坏血酸的还原作用形成一种“链状金线”，由多个纳米金原子形成串珠状，由此可大量富集抗体，但是此“链状金线”的合成过程至少需要5天时间，且无磁性，依然需要通过离心来进行分离，探针的分离过程繁琐。因此研发一种新的具有分离简便、富集率高的抗体富集材料并应用到电化学免疫传感器中具有重要的意义。ZrO2作为一种Lewis强酸，通过与蛋白分子上的羧酸和DNA上的磷酸等基团 (Lewis强碱)特异性取向结合，可被直接用来固定酶及抗体。由于抗体和酶包被在极细 (1 2 μ m)且表面积很大的纳米^O2上，标记量显著增加且能较长时间地保持生物活性。 但是单个纳米颗粒对二抗抗体的富集效果有限。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种二抗探针，该探针适于采用安培免疫传感器进行夹心免疫反应测量抗原的浓度，且具有富集抗体效果优异和检测限低的优点。为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是—种采用安培免疫传感器进行夹心免疫反应的二抗探针，该探针由小牛胸腺DNA 分子链和附着在小牛胸腺DNA分子链上的纳米球构成，其中所述的纳米球的表面为酶标记的抗体蛋白，内部为磁性纳米颗粒，该颗粒为在四氧化三铁纳米颗粒表面沉积一层无定形氧化锆形成。本专利技术所述的二抗探针，其中所述的磁性纳米颗粒为公知材料，具体制备方法可参照公开号为CN 101302361A的专利技术专利申请所述方案进行。本专利技术所述的二抗探针的制备方法由以下步骤组成1)将磁性纳米颗粒加入pH 7. 0磷酸盐缓冲液中，再加入重量为磁性纳米粒子0. 1 倍的辣根过氧化物酶标记抗体，4°C下反应6h，分离得到负载抗体的纳米微球；2)将所得到的纳米微球加入pH 7.0磷酸盐缓冲液中，再加入重量为所述纳米微球0. 1倍的过氧化物酶和重量为所述纳米微球1. 0倍的牛血清白蛋白，4°C下反应6h，分离得到纳米球；3)将纳米球加入pH 7.0磷酸盐缓冲液中，再加入重量为纳米球1.2倍的小牛胸腺 DNA,室温下反应6h，分离得到二抗探针。本专利技术所述的探针中，首先制备了具有核壳结构的!^e3O4(核)/&02(壳)磁性纳米粒子，该磁性纳米粒子表面含有&02可以和抗体结合，对抗体进行富集。该探针具有以下优点1)磁性材料的使用，使探针具有磁性，在外加磁场的作用下即可实现分离，省去了探针合成过程中繁琐的离心和洗涤过程；幻该探针呈“串珠状”，每个探针分子上具有10个以上磁珠，增加探针表面标记酶抗体浓度，因此提高免疫传感器的敏感性。3) 二氧化锆具有很好的生物相容性，能够长时间保持抗体的活性，使抗体不易失活，使本探针可以一次制备而长期保存。本专利技术所述的二抗探针可以用来检测抗原浓度，具体检测由以下步骤组成(a)定量标准曲线的制备(1)配制一系列不同浓度的抗原标准品溶液；(2)按相同的体积分别将每一浓度的抗原标准品溶液加入到安培免疫传感器的反应腔中，先37°C温育30min，洗涤；再将所制备的二抗探针滴加在安培免疫传感器的反应腔中，37°C温育30min，洗涤；然后，反应腔中加入含有浓度为5mmol/L过氧化尿溶液和lmmol/ L邻苯二酚的0. lmol/L磷酸盐缓冲溶液，反应;3min后，在电化学工作站上用循环伏安法 (CV)或示差脉冲伏安法(DPV)记录还原峰电流；(3)将步骤⑵所得到的抗原标准品溶液的浓度及其对应的还原峰电流的一组数据，以还原峰电流对抗原标准品溶液浓度进行线性回归便得到，还原峰电流与抗原标准品溶液浓度对应关系的直线方程，即标准曲线；(b)样品的检测将待测样品加入到安培免疫传感器的反应腔中，以步骤(a)同样的方法和反应条件采用循环伏安法(CV)记录还原峰电流，然后，将检测样品得到的还原峰电流值代入步骤 (a)所得到的直线方程中即可算出待测样品中抗原的浓度。上述检测抗原浓度的方法中所使用的安培免疫传感器可根据待测抗原按公知的方法自行制备。本专利技术所述的二抗探针适用于采用安培免疫传感器进行夹心免疫反应测量抗原4的浓度，由于本专利技术所述的二抗探针具有一维“串珠状”结构，极大的提高探针表面二抗的负载量，由于电化学免疫传感器的线性范围和灵敏度与二抗富集效果正相关，因此本专利技术所述检测抗原浓度的方法具有线性范围宽，检测限低的优点。附图说明图1是二抗探针的检测原理及二抗探针合成过程示意图。右侧方框内是二抗探针的合成过程示意图。图2是合成的探针利用外加磁场进行分离结果图。图3是下述实施例1所合成的二抗探针的透射电镜图；图4是不同浓度AFP检测时的电化学CV响应图，其内插图为测定标准曲线。图5是不同浓度HIV pM检测时的电化学DPV响应图，其内插图为测定标准曲线。具体实施例方式实施例11、二抗探针的制备和表征(1)磁性纳米颗粒的制备磁性纳米颗粒的制备具体制备方法可参照公开号为CN 101302361A的专利技术专利申请°磁性纳米颗粒的表征采用X射线荧光光谱(XRF)对!^e3O4AiO2进行表征，出现了 Zr-K0 (17. 8keV)、Zr-Ka (15. 8keV)、Zr-L0 (2. Ike)、Zr-La (2. OkeV)峰和 Fe-K0 (7. IKeV)、 Fe-Ka (6. 4keV)峰，说明该磁性微粒中存在rLx和！^元素。(2)负载抗体的纳米微球的制备和表征负载抗体的纳米微球的制备将IOmg磁性纳米粒子分散在5mL pH 7. 0磷酸盐缓冲液中，加入Img辣根过氧化物标记的甲胎蛋白本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种采用安培免疫传感器进行夹心免疫反应的二抗探针，该探针由小牛胸腺ＤＮＡ分子链和附着在小牛胸腺ＤＮＡ分子链上的纳米球构成，其中所述的纳米球的表面为酶标记的抗体蛋白，内部为磁性纳米颗粒，该颗粒为在四氧化三铁纳米颗粒表面沉积一层无定形氧化锆形成。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：郑磊，贾立永，干宁，王前，李博，巫远招，
申请(专利权)人：南方医科大学，
类型：发明
国别省市：81
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