玉米转录因子ZmWRKY33基因的应用制造技术

本发明专利技术属于作物遗传育种领域，具体涉及一种与玉米耐盐相关的转录因子基因及其应用。该基因为玉米WRKY家族转录因子基因ZmWRKY33,该玉米ZmWRKY33基因用于植物转化，提高植物的耐盐能力。可用于其他作物的抗逆转基因应用。该抗逆基因来自植物本身，对环境影响较小。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于作物遗传育种领域，具体涉及玉米转录因子基因的功能及其应用。
技术介绍
全世界约有三分之一的土地为盐碱地，在盐胁迫下，植物生长缓慢，新陈代谢受到强烈抑制，严重时出现盐斑，萎蔫，甚至是植株死亡的情况，显而易见，土壤盐渍化严重影响了农业生产和生态环境。干旱、高盐会造成植物不同程度的脱水，引起植物体内一系列的生理代谢变化，所以又将干旱、高盐等非生物胁迫称为水分胁迫，或渗透胁迫。植物应答渗透胁迫的过程是一个涉及到多基因、多信号途径、多基因产物的复杂过程，大体上可将这些基因及其表达产物分成两类，即功能蛋白和调节蛋白。功能蛋白是指在抵抗渗透胁迫中直接起作用的蛋白质；而调节蛋白是在逆境中参与各种信号转导或调控基因表达，间接起保护作用的蛋白，主要包括传递信号和调控基因表达的转录因子等。植物在逆境胁迫下可诱导合成大量抗逆的化合物和蛋白质，这些与抗逆境相关的化合物和蛋白质又受转录因子在转录水平上的调控.转录因子可以通过与顺式作用元件结合，启动抗逆相关功能基因的转录，通过抗逆功能基因的表达使植物作出适应逆境胁迫的代谢调整。近年来，在提高作物抗逆性的分子育种中，研究重点已逐渐从改良个别基因转到改良或增强一个或多个发挥关键作用的转录因子上，这样能促使多个功能基因发挥作用，以期获得综合抗逆性状改良的植物。植物WRKY家族转录因子能够与(T) TGAC (C/T)序列(又称W-box)发生特异性作用，调节启动子中含W-box元件的功能基因或调控基因的表达，从而参与植物的各种抗逆性反应。目前有关WRKY家族转录因子的研究大部分来自水稻和拟南芥，而其它物种的研究报道不多。电子克隆(in silico cloning)是近年来伴随着基因组计划和EST计划发展起来的基因克隆的新方法。其原理是利用日益发展的生物信息学技术，借助电子计算机的巨大运算能力，通过EST或基因组的序列组装和拼接，再利用RT-PCR的方法快速地获得新基因。本专利技术以玉米为研究材料，以拟南芥中与抵抗高盐有关的转录因子WRKY33为查询序列，同源搜索玉米核苷酸数据库，通过生物信息学的方法找到玉米中与抵抗非生物胁迫有关的WRKY转录因子基因。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供玉米转录因子為MXTJJ基因的序列及功能，并进一步公开了该基因的应用。本专利技术通过对基因在玉米受高盐胁迫时的表达模式判断，该基因可能参与植物抗逆途径。根据该基因的序列设计引物，利用RT-PCR技术从玉米品种郑单958总 cDNA中扩增得到基因。利用农杆菌蘸花法转化到野生型拟南芥植株中，并研究其在拟南芥体内的抗逆功能，为ZmWRKY33基因在其他植物上的应用提供了很好的基础。本专利技术所述的玉米基因可用于植物转化，提高植物的耐盐能力。本专利技术还公开了一种提高植物耐盐能力的方法，即利用玉米基因转化目标植物，从而获得转基因植物。所述的提高植物耐盐能力的方法，包括下述步骤(1)用电子克隆的方法获得玉米转录因子基因ZmWRKY33,(2)用RT-PCR获得玉米ZfflTMTJJ基因片段，(3)将基因片段构建到质粒载体中，(4)利用电击法将步骤(3)得到的带有的质粒转化农杆菌，(5)将带有转化质粒的农杆菌采用蘸花法转化目标植物，(6)目标植物转基因阳性苗的鉴定。本专利技术步骤(2)是根据基因的序列设计如下引物 L3 :5，-ATGGCGTCCTCCACGGGGAGCTT-3，(SEQ ID NO. 1),R3 :5’ -CTAGCAGAGGAGCGAGTCGACGAAC-3，(SEQ ID NO. 2)；利用RT- PCR技术从玉米总cDNA中扩增得到基因全长cDNA(开放阅读框部分)。本专利技术根据ZmWRKY33基因的cDNA序列设计如下检测引物 1497几5，-GTGGTCCAGACGATGAGCGACAT -3，(SEQ ID NO. 3), 1497JR: 5，- GCTGCTCAGCATCTCCAGGGTGT -3，(SEQ ID NO. 4)。检测玉米经过NaCl处理后体内ZmWRKY33基因的表达情况。结果表明ZmWRKY33 受NaCl诱导表达。本专利技术步骤(3 )是将扩增得到的ZmWRKY33基因片段克隆到pCAMBIA_1304 (AF234300. 1)(购买于上海皓嘉生物科技有限公司)载体中，构建的新载体命名为 pZmWRKY33。为了更好的表达外源基因，还可在pZmWRKY33载体的多克隆位点处两侧插入了烟草的染色质附着SAR序列，这有利于转基因的稳定遗传及表达；外源基因的表达单元内， 在目的基因的两侧导入了 BamH I和Mc I酶切位点，便于外源基因的插入，外源基因的表达由双CAMV 35S启动子 + TMV Omega leader sequence控制；CAMV 35S+TMV Omega leader sequence控制Hyg抗性基因的表达，作为转基因植物的筛选标记基因。本专利技术利用电击法将构建好的双元载体pZmWRKY33导入根癌农杆菌中，根癌农杆菌菌株为EHA105。通过农杆菌蘸花法将耐盐相关的转录因子基因转化到拟南芥中，然后验证了转基因拟南芥对盐胁迫的耐受能力得到提高。本专利技术的基因是能够针对性调控植物耐盐能力提高的转录因子基因； 且该抗逆基因来自植物本身，对环境影响较小。本专利技术通过对基因转化拟南芥进行该基因的功能研究，获得效果如下 1.获得了对盐胁迫有较高耐受性的转基因拟南芥植株。2. ZmWRKY33基因具有抵抗盐胁迫逆境的功能，为利用该基因在其他植物上的应用而提高植物抗逆性提供了理论依据及利用价值。附图说明图1 ZmWRKY33与其它物种WRKY家族转录因子保守区的氨基酸序列同源性比对。 完全相同的氨基酸用黑色方框表示，WRKY结构域以下划线所示。图2 ZmWRKY33与其它WRKY转录因子氨基酸序列比对后所作进化树。ZmWRKY33 与其它单子叶植物的WRKY转录因子，如水稻的0sWRKY53和小麦的TaWRKYH分在一个分支；与ZmWRKY33亲缘关系最近的双子叶植物WRKY转录因子是拟南芥的AtWRKY33和烟草的 NtffRKYU NtffRKY2图3 ZmWRKY33基因在高盐诱导时的表达谱变化情况。ZmWRKY33基因在受到盐胁迫1 小时后表达量开始升高，到12小时到达顶峰。图4 T1代转基因拟南芥植株的PCR检测。M :DL2000 Marker ；1, 2 野生型植株； 3-14 =T1代转基因植株。图5野生型和转基因拟南芥对200mM NaCl胁迫的反应。左边为野生型植株，白线右边为转基因植株。图6野生型和转基因拟南芥对50mM NaCl胁迫的反应。黑线左边为野生型植株， 黑线右边为转基因植株。具体实施例方式实施例1 玉米转录因子ZfflTMTJJ的电子克隆登陆公共数据库NCBI主页(http://WWW. ncbi. nlm. nih. gov/)，搜索到拟南芥中与抵抗高盐胁迫有关的转录因子WRKY33的氨基酸序列，以此氨基酸序列为查询探针，用NCBI的 tblastn程序同源搜索NCBI的玉米EST数据库。将在玉米EST数据库中得到高度同源EST 序列用CAP程序拼接成重叠群(contig)；以此重叠群作为查询探针，重新搜索NCBI的玉米 EST本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．玉米ＺｍＷＲＫＹ３３基因用于植物转化，提高植物的耐盐能力。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈建民，黎华，邓德祥，高勇，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：32