一种牛诱导性多能干细胞诱导方法技术

本发明专利技术公开了一种牛诱导性多能干细胞诱导方法，利用外源限定因子与增强型绿色荧光蛋白(Enhanced?green?fluorescent?protein，EGFP)报告基因构建融合蛋白慢病毒表达载体用于牛诱导性多能干细胞的诱导，对表达外源限定因子融合蛋白的牛胎儿成纤维细胞进行培养传代，逐步分离培养出集落边缘界限清晰的细胞克隆，细胞集落生长状态稳定，核型正常，碱性磷酸酶检测为阳性，免疫细胞化学检测显示Oct4、Nanog、SSEA-1蛋白表达为阳性，体内能够分化形成含有三个胚层的畸胎瘤，结果证实分离培养的细胞克隆具有胚胎干细胞样特征，得到牛诱导性多能干细胞。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
１．一种牛诱导性多能干细胞诱导方法，其特征在于，包括以下步骤：（１）、限定因子慢病毒表达载体的构建：根据猪Ｓｏｘ２、ｃ－Ｍｙｃ、Ｋ１ｆ４基因的ｍＲＮＡ序列和人Ｏｃｔ４的ＤＮＡ序列，设计合成出ｐＳｏｘ２、ｐＫ１ｆ４、ｐｃ－Ｍｙｃ、ｈＯｃｔ４基因的上、下游引物；从猪囊胚中提取总ＲＮＡ，利用设计合成出的ｐＳｏｘ２、ｐＫ１ｆ４和ｐｃ－Ｍｙｃ基因的上、下游引物经ＲＴ－ＰＣＲ扩增出猪限定基因ＤＮＡ，人Ｏｃｔ４的ＤＮＡ序列经ｈＯｃｔ４基因的上、下游引物直接从人Ｏｃｔ４基因中扩增获取，将猪限定基因ＤＮＡ和人Ｏｃｔ４的ＤＮＡ序列进行酶切，然后与逆转录病毒载体ｐＬＥＧＦＰ－Ｎ１连接，构建出逆转录病毒融合蛋白表达载体，从逆转录病毒融合蛋白表达载体中扩增出ＣＭＶ启动子连同限定基因及ＥＧＦＰ基因，同时通过酶切从ｐＬＬ３．７质粒中移除Ｕ６启动子、ＣＭＶ启动子和ＧＦＰ序列，最后把ＣＭＶ启动子连同限定基因及ＥＧＦＰ基因与酶切后的ｐＬＬ３．７进行重组，构建出慢病毒限定基因融合蛋白重构表达载体；所述的ｐＳｏｘ２、ｐＫ１ｆ４、ｐｃ－Ｍｙｃ、ｈＯｃｔ４基因的上、下游引物序列为：ｐＳｏｘ２上游：５’－ＴＴＴＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＴＡＣＡＡＣＡＴＧＡＴＧＧＡＧＡＣ－３’；下游：５’－ＡＡＡＧＧＡＴＣＣＧＧＣＡＴＧＴＧＡＧＡＧＡＧＡＧＧＣＡＧＴＧＴＡＣ－３’；ｐＫ１ｆ４上游：５’－ＴＡＴＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＴＧＴＣＡＧＣＧＡＣＧＣＡＣ－３’；下游：５’－ＧＧＣＧＧＡＴＣＣＧＧＡＡＡＡＴＧＣＣＴＣＴＴＣＡＴＧＴＧＴＡＡＧＧＣ－３’；ｐｃ－Ｍｙｃ上游：５’－ＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＣＣＣＴＧＧＡＴＴＴＣＣＴＴＣＧＧＡＴＡＧ－３’；下游：５’－ＡＡＡＧＧＡＴＣＣＧＣＴＧＧＧＣＡＡＧＡＧＴＴＣＣＧＴＡＧＣＴＧ－３’；ｈＯｃｔ４上游：５’－ＡＡＴＧＴＣＧＡＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＧＧＧＡＣＡＣＣＴＧＧＣＴＴＣ－３’；下游：５’－ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＣＴＣＡＧＴＴＴＧＡＡＴＧＣＡＴＧＧＧＡＧＡＧＣ－３’。（２）、牛胎儿成纤维细胞的诱导：采用组织块培养法建立牛胎儿成纤维细胞系，采用磷酸钙法转染慢病毒限定基因融合蛋白重构表达载体的四因子质粒ＰＬＬ－ｈＯＣＴ４／ｐＳＯＸ２／ｐＭＹＣ／ｐＫＬＦ４，同时将慢病毒包装产生病毒需要的辅助质粒ｐＭＤＬｇ、ｐＲＳＶ　ＲＥＶ和ｐＶＳＶｇ包装到２９３Ｔ细胞，１２－１６ｈ后换２９３Ｔ细胞新鲜培养液，病毒包装４８ｈ后收集含病毒培养液，经超滤浓缩后添加到含有牛胎儿成纤维细胞培养板内，感染１８－２０天后，细胞出现初步形态变化后将感染的细胞经Ｄｉｓｐａｓｅ　ＩＩ消化，接种至丝裂霉素Ｃ处理过的小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上进行培养，感染２３－２５天后，牛胚胎干细胞样克隆明显可见。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：曹鸿国，章孝荣，张运海，李运生，殷慧群，陶勇，刘亚，方富贵，刘旭光，任春环，张子军，丁建平，刘洪瑜，王力生，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：34