本发明专利技术提供一种造血祖细胞的制备方法及其专用培养基，所述专用培养基由分化培养基I-1或分化培养基I-2，分化培养基II-1或分化培养基II-2和分化培养基III-1或分化培养基III-2组成；所述分化培养基I-2为在第一阶段分化培养基中添加人BMP4和人Wnt3a得到的培养基；所述分化培养基II-2为在第二阶段分化培养基中添加人血管内皮细胞生长因子和人碱性成纤维细胞生长因子得到的培养基；所述分化培养基III-1为第三阶段分化培养基；所述分化培养基III-2为在第三阶段分化培养基中添加全反式视黄酸(RA)得到的培养基；本发明专利技术提供的方法产生的造血祖细胞适合作为人原代造血祖细胞的替代品。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种造血祖细胞的制备方法及其专用培养基。
技术介绍
人胚胎干细胞有自我更新和分化为所有体细胞的能力(Thomson，J. Α., Itskovitz-Eldor, J. , Shapiro, S. S. , Waknitz, Μ. Α. , Swiergiel, J. J. , Marshall, V. S., and Jones, J. Μ. (1998). Embryonic Stem Cell Lines Derived from HumanBlastocysts. Science观2，1145-1147)。这些能力意味着人胚胎干细胞可以作为人类中胚层和造血系统发育的研究平台。进而，还可以为人类造血细胞的临床移植提供稳定的供体细胞。目前已有多个实验室报道了人胚胎干细胞定向分化为造血细胞的方法(Murry，C. Ε.，and Keller, G. (2008). Differentiation of Embryonic Stem Cellsto Clinically Relevant Populations :Lessons from Embryonic Development. Celll32,661-680)。这些方法虽然都由人胚胎干细胞分化产生了造血干/祖细胞，但是它们的分化过程都是不确定的。这种不确定主要表现在采用了基质细胞共培养和血清培养基的分化体系，如滋养层细胞共培养，或含胎牛血清的培养液培养；没有完全模拟体内造血系统的发育过程。造血-内皮前体细胞(hemangioblast)是指在造血发育过程中产生的一类同时具有向造血细胞和内皮细胞两个方向分化能力的前体细胞(Xiong，J.-W. (2008). Molecular and developmental biology of the hemangioblast. DevelopmentalDynamics 237，1218-1231.)。鉴于目前的研究均没有完全模拟体内造血系统的发育过程，因此，人胚胎干细胞的体外分化仍是研究的热点。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种用于诱导人胚胎干细胞分化为造血祖细胞的培养基。本专利技术提供的诱导人胚胎干细胞分化为造血祖细胞的培养基，由分化培养基I，分化培养基II和分化培养基III组成；分化培养基I为分化培养基I-I或分化培养基1-2 ；分化培养基II为分化培养基II-I或分化培养基II-2 ；分化培养基III为分化培养基III-I 或分化培养基II1-2;所述分化培养基I-I为在第一阶段分化培养基中添加骨形态发生原蛋白-4(BMP4)得到的培养基；所述分化培养基I-I中的所述骨形态发生原蛋白-4的终浓度为 10-100ng/ml ；所述分化培养基1-2为在第一阶段分化培养基中添加骨形态发生原蛋白-4和 Wnt3a得到的培养基；所述分化培养基1-2中的所述骨形态发生原蛋白-4的终浓度为 10-100ng/ml，所述 Wnt3a 的终浓度为 50_150ng/ml ；所述分化培养基II-I为在第二阶段分化培养基中添加血管内皮细胞生长因子得到的培养基；所述分化培养基II-I中的所述血管内皮细胞生长因子的终浓度为50-150ng/ ml ；所述分化培养基II-2为在第二阶段分化培养基中添加血管内皮细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子得到的培养基；所述分化培养基II-2中的所述血管内皮细胞生长因子的终浓度为50-150ng/ml，所述碱性成纤维细胞生长因子的终浓度为50-150ng/ml ；所述分化培养基III-I为第三阶段分化培养基；所述分化培养基III-2为在第三阶段分化培养基中添加全反式视黄酸(RA)得到的培养基；所述分化培养基III-2中的所述全反式视黄酸的终浓度为1-5 μ M ；所述骨形态发生原蛋白-4(ΒΜΡ4)可以为人骨形态发生原蛋白_4，也可以为鼠骨形态发生原蛋白-4;所述Wnt3a可以为人Wnt3a，也可以为鼠Wnt3a;所述血管内皮细胞生长因子(VEGF)可以为人血管内皮细胞生长因子或者鼠血管内皮细胞生长因子；所述碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)可以为人碱性成纤维细胞生长因子或者鼠碱性成纤维细胞生长因子；所述第一阶段分化培养基为在用于培养哺乳动物细胞的基础细胞培养基上添加牛血清白蛋白(BSA)得到的培养基；所述第一阶段分化培养基中的所述牛血清白蛋白的终浓度为 0. 1-lmg/ml ；所述第二阶段分化培养基为在所述第一阶段分化培养基上添加胰岛素-转铁蛋白-硒盐(ITS)、维生素C酸和硫代甘油得到的培养基；所述第二阶段分化培养基中的所述胰岛素-转铁蛋白-硒盐的终浓度为0. 5-1. 5% (体积百分含量)，所述维生素C酸的终浓度为0. 1-lmmol/l，所述硫代甘油的终浓度为0. 1-lmmol/l ；所述第三阶段分化培养基为将所述第二阶段分化培养基中的胰岛素-转铁蛋白-硒盐替换成B27添加剂(B27)得到的培养基；所述第三阶段分化培养基中的所述B27 添加剂的终浓度为0. 5-1. 5% (体积百分含量)。所述分化培养基I-I和1-2中的所述骨形态发生原蛋白-4的终浓度均可为10、 20、40、50、60、80或100ng/ml，所述分化培养基1_2中的所述Wnt3a的终浓度可为50、60、 80、100、120 或 150ng/ml ；所述分化培养基II-I和II-2中的所述血管内皮细胞生长因子的终浓度均可为 50、60、80、100、120或150ng/ml，所述分化培养基II-2中的所述血管内皮细胞生长因子的终浓度可为 50、60、80、100、120 或 150ng/ml ；所述分化培养基III-2中的所述全反式视黄酸的终浓度可为1、1. 2,1. 5、2、2. 5、 3、4 或 5μΜ;所述第一阶段分化培养基中的牛血清白蛋白的终浓度可为0. 1、0.2、0.4、0.5、 0. 6、0· 8 或 lmg/ml ；所述第二分化培养基中的所述维生素C酸的终浓度可为0. 1、0.2、0.4、0.5、0.6、 0. 8或lmmol/1，所述硫代甘油的终浓度可为0. 1,0. 2,0. 4,0. 5,0. 6、0. 8或lmmol/1，所述胰岛素-转铁蛋白-硒盐的终浓度可为0. 5%,0. 7%,0.9%U%>1. 2%、1.4%或1. 50% ；所述第三阶段分化培养基中的所述B27添加剂的终浓度可为0.5 %、0. 7 %、 0. 9%Λ%Λ. 2%Λ. 4%或 1. 50%。所述分化培养基I-I和1-2中的所述骨形态发生原蛋白-4的终浓度均优选为20-80ng/ml,尤其优选为50ng/ml，所述分化培养基1_2中所述Wnt3a的终浓度优选为 80-120ng/ml，尤其优选为lOOng/ml ；所述分化培养基II-1和II-2中的所述血管内皮细胞生长因子的终浓度均优选为80-120ng/ml，尤其优选为lOOng/ml，所述分化培养基II-2中所述碱性成纤维细胞生长因子的终浓度优选为80-120ng/ml，尤其优选为lOOng/ml ；所述分化培养基III-2中的所述全反式视黄酸的浓度优选为1. 2-3μΜ，尤其优选为2μΜ ；所述第一阶段分化培本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．诱导人胚胎干细胞分化为造血祖细胞的培养基，由分化培养基Ｉ，分化培养基ＩＩ和分化培养基ＩＩＩ组成；分化培养基Ｉ为分化培养基Ｉ－１或分化培养基Ｉ－２；分化培养基ＩＩ为分化培养基ＩＩ－１或分化培养基ＩＩ－２；分化培养基ＩＩＩ为分化培养基ＩＩＩ－１或分化培养基ＩＩＩ－２；所述分化培养基Ｉ－１为在第一阶段分化培养基中添加骨形态发生原蛋白－４得到的培养基；所述分化培养基Ｉ－１中的所述骨形态发生原蛋白－４终浓度为１０－１００ｎｇ／ｍｌ；所述分化培养基Ｉ－２为在第一阶段分化培养基中添加骨ｌ／ｌ，所述硫代甘油的终浓度为０．１－１ｍｍｏｌ／ｌ；所述第三阶段分化培养基为将所述第二阶段分化培养基中的胰岛素－转铁蛋白－硒盐替换成Ｂ２７得到的培养基，所述第三阶段分化培养基中的所述Ｂ２７的终浓度为０．５－１．５％（体积百分含量）。阶段分化培养基为在所述第一阶段分化培养基上添加胰岛素－转铁蛋白－硒盐、维生素Ｃ酸和硫代甘油得到的培养基；所述第二阶段分化培养基中的所述胰岛素－转铁蛋白－硒盐的终浓度为０．５－１．５％（体积百分含量），所述维生素Ｃ酸的终浓度为０．１－１ｍｍｏ述分化培养基ＩＩＩ－２中的所述全反式视黄酸的终浓度为１－５μＭ；所述第一阶段分化培养基为在用于培养哺乳动物细胞的基础细胞培养基上添加牛血清白蛋白得到的培养基；所述第一阶段分化培养基中的所述牛血清白蛋白的终浓度为０．１－１ｍｇ／ｍｌ；所述第二血管内皮细胞生长因子的终浓度为５０－１５０ｎｇ／ｍｌ，所述碱性成纤维细胞生长因子的终浓度为５０－１５０ｎｇ／ｍｌ；所述分化培养基ＩＩＩ－１为第三阶段分化培养基；所述分化培养基ＩＩＩ－２为在第三阶段分化培养基中添加全反式视黄酸得到的培养基，所因子得到的培养基；所述分化培养基ＩＩ－１中的所述血管内皮细胞生长因子的终浓度为５０－１５０ｎｇ／ｍｌ；所述分化培养基ＩＩ－２为在第二阶段分化培养基中添加血管内皮细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子得到的培养基；所述分化培养基ＩＩ－２中的所述形态发生原蛋白－４和Ｗｎｔ３ａ得到的培养基；所述分化培养基Ｉ－２中的所述骨形态发生原蛋白－４的终浓度为１０－１００ｎｇ／ｍｌ，所述Ｗｎｔ３ａ的终浓度为５０－１５０ｎｇ／ｍｌ；所述分化培养基ＩＩ－１为在第二阶段分化培养基中添加血管内皮细胞生长...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：邓宏魁，于晨，
申请(专利权)人：北京大学，北京华源博创科技有限公司，
类型：发明
国别省市：11
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