本发明专利技术公开了鳜传染性脾肾坏死病毒（ISKNV）ORF093蛋白在制备预防鳜传染性脾肾坏死病毒病疫苗或药物中的应用。本发明专利技术的鳜ISKNVORF093蛋白对鳜虹彩病毒病有较好的免疫预防作用，保护率超过45%，可以开发成为抗鳜鱼传染性脾肾坏死病毒病新疫苗或新药物。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程
，具体涉及鳜传染性脾肾坏死病毒(ISKNV) 0RF093 蛋白的应用。
技术介绍
鳜LSinipercei chuatsi)是我国重要的淡水鱼特色养殖品种之一，由传染性脾肾Infectious spleen and kidney necrosis virus, ISKNV)弓白勺病是鳜鱼养殖的主要疫病，导致鳜死亡率接近100%，成为制约鳜养殖业发展的主要瓶颈。 长期以来，对于鳜病毒病的防治一直没有有效的药物，而且抗生素、化药等防治疾病弊端众多，如病原耐药性、环境污染、食品安全问题等。因此作为符合环境友好和可持续发展战略的病害控制措施，疫苗、抗血清等生物制剂正成为国际现代水产养殖业的标准生产规范和研究开发的前沿热点领域。因此，研制与发展鳜传染性脾肾坏死病毒病疫苗及治疗制剂对防治鳜鱼虹彩病毒病具有战略意义，寻找新的疫苗候选抗原及抗病毒血清是当今鳜鱼虹彩病毒病研究的重点之一。传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)是虹彩病毒科肿大细胞属的代表种，为细胞质内寄生的具囊膜二十面体病毒，直径为150nm，含有双链DNA，基因组由111，362个碱基组成，包括125个预测开放读码框ORF (open reading frames)，鳜鱼是其主要感染宿主。目前控制病毒性疾病主要有两种手段接种疫苗和使用抗病毒药物。在鳜虹彩病毒病疫苗研究方面，潘厚军等采用灭活组织浆疫苗对其进行防治，在室内和田间实验效果较好，但是由于疫苗材料来源于病鳜内脏组织，受季节和数量上的限制，推广应用有一定的困难。由于基因工程疫苗不受上述条件的限制，成为研制鳜ISKNV疫苗的一个理想的方法。2004年，张敏等进行了 ISKNV主衣壳蛋白(Major capsid protein, MCP)的原核表达，采用免疫印记的方法初步确定了重组MCP蛋白与ISKNV MCP蛋白有相同的抗原特性，为ISKNV重组亚单位疫苗的研制提供了思路。2009年，付小哲等对重组MCP蛋白的免疫原性进行了初步研究，发现重组 MCP蛋白有较好的免疫原性，可以激发鳜特异性免疫及非特异性免疫应答。在其他虹彩病毒病疫苗研制方面，日本的研究人员研制出抗真鲷虹彩病毒(RSIV)细胞灭活疫苗，免疫保护率在75%以上，是亚洲地区唯一成功进行商业化生产和应用鱼类病毒性疾病的疫苗。日本研究人员还对RSIV核酸疫苗(0RF380R，ORF 569R)进行了研究，结果显示重组核酸疫苗能够产生45 60%左右的免疫保护。Park等根据0RF055构建了条石鲷虹彩病毒(RBIV)核酸疫苗，结果显示免疫真鲷血清在BF-2细胞上对病毒具有一定的中和作用，但尚无免疫保护数据。在抗血清等抗病毒药物方面尚无相关研究。到目前为止，还没有出现以ISKNV 0RF093基因作为疫苗前体及其抗血清制剂的研究报道。
技术实现思路
本专利技术提供了鳜传染性脾肾坏死病毒(ISKNV) 0RF093蛋白在制备预防鳜传染性脾肾坏死病毒病疫苗及药物中的应用。本专利技术所采用的技术方案如下鳜传染性脾肾坏死病毒(ISKNV) 0RF093蛋白在制备预防鳜传染性脾肾坏死病毒病疫苗或药物中的应用。优选的，所述(ISKNV) 0RF093蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。本专利技术具有以下有益效果鳜ISKNV 0RF093蛋白对鳜虹彩病毒病有较好的免疫预防作用，由0RF093重组蛋白制备的抗血清对鳜虹彩病毒病也有较好的中和效果。制备的0RF093重组核酸疫苗免疫鳜鱼 30天后，保护率超过45%，由0RF093重组蛋白制备的兔抗血清对ISKNV也有较强的中和作用，中和液注射鳜鱼观天后，相对存活率超过56%。因此，鳜ISKNV 0RF093蛋白可以开发成为抗鳜鱼传染性脾肾坏死病毒病新疫苗或新药物。附图说明图 1 是 ISKNV 0RF093 基因的 PCR 扩增图，其中 M 为 maker，1 为 ISKNV 0RF093 基因；图2是SDS-PAGE分析ISKNV 0RF093重组融合蛋白的表达图，其中1为蛋白marker， 2为pET3h(+)空载，3为诱导表达上清，4为诱导表达前菌体，5、6为诱导表达后菌体总蛋白；图3是SDS-PAGE分析ISKNV 0RF093重组融合蛋白的纯化图，其中1为蛋白marker，2 为pET32a(+)空载，3为纯化后的重组蛋白，4为表达重组蛋白包涵体；图4是重组质粒pET3h-093表达产物的western- bloting分析图，其中1为 pET32a(+)空载，2为0RF093重组蛋白，3为预染蛋白marker ；图5是免疫斑点检测ISKNV图，其中1为鳜脑细胞，2为细胞培养的ISKNV。具体实施例方式以下结合实施例对本专利技术作进一步的说明，但并不局限于此。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。实施例11鳜ISKNV 0RF093重组蛋白在大肠杆菌中的原核表达1.1根据GenBank中传染性脾肾坏死病毒(ISKNV) 0RF093序列(SEQ ID NO: 1)设计引物，并引入酶切位点(以下划线标注)。引物序列如下Pl [5~- CGGAATTCATGAATAAAACGC -3，(SEQ ID NO :3)，引入 EcoR I 酶切位点； P2 [5' - CGGAAGCTTTTAAACATGGCGTC -3，(SEQ ID NO :4)，引入 Hind III酶切位点。1.2以本实验室自保存的鳜ISKNV基因组为模板进行PCR扩增，25 μ L PCR反应体系包含10 Xbuffer (含 Mg2+)2. 5 μ L，4X dNTP (10mmol/L)0. 5 μ L，上下游引物(20 μ mol/ L)各 0.5 μ L，Taq DNA 聚合酶(5U/μ L) 0. 3 μ L，DNA 1. 0 μ L，无菌双蒸水补足。PCR 反应条件94°C预变性4min ；94°C变性45S，50°C复性45S，72°C延伸30S，30个循环；72°C延伸 IOmin0 PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，结果显示，在900bp左右出现亮带，片段大小与预期927bp基本相符(见图1 )，将目的产物进行胶回收纯化，送至测序公司测序，序列见 SEQ ID N0:1。1.3将纯化后的ISKNV 0RF093 PCR产物及提取的原核表达质粒pET3h ( + )，分别用Hind III和EcoR I进行双酶切。ρΕΤ3^ι ( + )的酶切体系为10XNEB Buffer 5 μ L， 100 X BSA 0. 5μ L, EcoR I (20U/y L) 1 μ L, Hind III(20U/y L) 1 μ L, pET32a ( + ) 15 μ L (7μ g/μ L)，灭菌双蒸水补足50μ L。0RF093 PCR产物酶切体系为10XNEB Buffer 5 μ L， 100XBSA 0. 5 μ LjEcoR I (20U/μ L)1 μ L，Hind III(20U/μ L)1 μ L，0RF09340 μ L (2. 5μ g/ μ L)，灭菌双蒸水补足50 μ L0将酶切产物进行本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．鳜传染性脾肾坏死病毒（ＩＳＫＮＶ）ＯＲＦ０９３蛋白在制备预防鳜传染性脾肾坏死病毒病疫苗或药物中的应用。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：付小哲，吴淑勤，李宁求，石存斌，潘厚军，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院珠江水产研究所，
类型：发明
国别省市：81
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