一种绵羊肺炎支原体Hsp70(DnaK)C末端基因重组质粒，其构成方法为：首先设计并合成如下引物：P2:GGGGTCGACTTAATTTTGTTTGATTTC；P3:CAGGGATCCACTCCTTTAACTTTAGG，再以质粒T-Hsp70为模板，利用上述引物P2、P3进行PCR扩增，得到Hsp70C末端基因cDNA片段，片段大小约为700bp，将该片段与pET28a(+)相连接，获得重组质粒pET28a(+)-Hsp70C，进一步将重组质粒转化至BL21（DE3）中，并对表达产物进行SDS-PAGE，得到大小约为29kDa的目的蛋白。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物学、分子生物学与基因工程研究领域，涉及微生物学、分子生物学与基因工程的相关实验方法与技术，特别涉及一种绵羊肺炎支原体Hsp70 (DnaK) C末端基因重组质粒。
技术介绍
绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae, MO)能感染并危害绵羊，是引起绵羊传染性胸膜肺炎(Contagious ovine pleuropneumonia)的主要致病菌，并且也能感染 1-3月龄的羔羊和山羊。绵羊传染性胸膜肺炎是一种绵羊慢性呼吸道传染病，以咳嗽、喘气， 渐进性消瘦及慢性增生性间质性肺炎为主，是一种世界性的传染病。研究认为，热休克蛋白70 (Hsp70)，也称DnaK，具有多种生物学功能，包括分子伴侣功能，参与免疫反应，抗细胞凋亡功能，抗氧化功能，提高细胞的应激耐受性，促进细胞增殖，参与细胞骨架的形成和修复等等，广泛的生物学功能使其成为当今生命科学研究中的热点。进一步研究认为，Hsp70不仅具有良好的免疫原性，可诱导和增强机体体液免疫和细胞免疫的发生，同时它还具有免疫佐剂的功能。到目前为止，绵羊肺炎支原体基因组全序列尚未见报道。本研究在先期首次克隆获得Hsp70 (DnaK)基因全长cDNA的基础上，利用 DNAstar对Hsp70蛋白进行二级结构预测，分析结果显示α螺旋在整个蛋白质中均有分布， 其中50-175、210-250、480-576是主要分布区，尤其是在C末端的480-576区含有大量的α 螺旋结构，该结构的出现可能与蛋白质跨膜结构有关。而整个蛋白质当中β折叠较少，仅在360-380区有较少的β折叠。分析还表明C末端还具有较强亲水性，很有可能是蛋白质的抗原表位。表面抗原分析MO Hsp70的结果较为复杂，有多处区段都有可能处在蛋白质表面，其中在MO Hsp70C末端分布较为连续。在350-390区是蛋白质的跨膜区)，蛋白质的螺旋卷曲集中在218-256、472-5沈、530-580区。通过对MO Hsp70蛋白质二级结构的预测分析发现:M0 Hsp70C末端有较强的亲水性和较多的螺旋卷曲结构；α螺旋结构在C末端也大量集中出现，这与蛋白质的跨膜结构有关；抗原表位结果显示在C末端连续分布。上述结果预测MO Hsp70C末端是抗原表位。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种绵羊肺炎支原体Hsp70(DnaK)C末端基因重组质粒，从而为后续的绵羊肺炎支原体的分子生物学研究、相关疫病临床诊断试剂与基因工程疫苗的研制等奠定了坚实的基础。本专利技术的目的按照下述技术方案实现根据MO hsp70基因序列及引物设计原则设计并合成如下引物P2 -GGG GTCGAC TTAATTTTGTTTGATTTC ；P3 :CAG GGATCC ACTCCTTTAACTTTAGGo 其中 P2 和 P3 阴影处分别表示 Sal I和BamH I的酶切位点；以质粒T_Hsp70 (含MO Hsp70全长cDNA序列)为模板，利用上述引物P2、P3，进行PCR扩增得到了 Hsp70C末端基因cDNA片段，片段大小约为700bp。将该片段与pET28a(+)相连接，获得了重组质粒pET28a(+)-HSp70C，酶切鉴定与核苷酸序列测定结果表明目的基因序列和阅读框架正确。进一步将重组质粒转化至BL21(DE3)中， 并对表达产物进行SDS-PAGE，得到大小约为^kDa的目的蛋白；Western blotting分析表明，目的蛋白表达特异，且可特异性识别临床血清。本专利技术在前期克隆获得MO Hsp70全长基因的基础上，对Hsp70C末端基因700bp 进行了克隆与原核重组质粒的构建，并对重组质粒所表达目的蛋白的生物学特性进行了初步研究。实验结果为绵羊肺炎支原体的分子生物学研究、相关疫病临床诊断试剂与基因工程疫苗的研制等奠定了坚实的基础。附图说明图1是本专利技术PCR扩增Hsp70C末端基因电泳图，其中1. Marker2000, 2. PCR电泳结果；图2是本专利技术表达载体酶切电泳图，其中l.Marker 10000 ；2. BamH I单酶切片断，3. BamH I/Sal I 双酶切片断，4. PCR 鉴定；5. Marker 2000 ；图3是本专利技术重组质粒pET28a-HSp70-C测序结果；图 4 是本专利技术 BL21 (DE3) (pET28a(+) -Hsp70-C)表达产物 SDS-PAGE 图谱；其中:1.BL21(DE3)(pET_22b(+))表达产物；2. BL21 (DE3) (pET28a(+) -Hsp70-C)诱导 3h 表达产物；3. BL21 (DE3) (pET28a(+) -Hsp70-C)诱导 4h 表达产物；4. Protein Marker ；图 5. BL21 (DE3) (pET28a(+) -Hsp70-C)表达产物 Western blotting 结果，其中:1.BL21(DE3)(pET28a(+))表达产物，2.预染 Protein Marker ；图6. BL21 (DE3) (pET28a (+)-Hsp70-C)表达产物与临床血清反应结果；其中1-5 表达产物与血凝抑制实验阳性血清反应结果；6-8 表达产物与血凝抑制实验阴性血清反应结果。具体实施例方式一、MO Hsp70C末端基因的克隆根据MO hsp70基因序列及引物设计原则设计并合成如下引物P2 GGGGTCGACTTAATTTTGTTTGATTTC ；P3 CAGGGATCCACTCCTTTAACTTTAGG 其中 P2 和 P3 阴影处分别表示Ml I和BamH I的酶切位点。利用PCR技术，以P2和P3为引物，以T_Hsp70质粒(含MO Hsp70全长cDNA序列)为模板，扩增了 Hsp70C末端基因700bp片段(见图1)。二、MO Hsp70C末端基因原核表达载体的构建将Hsp70C末端基因扩增产物和表达载体pET28a (+)分别经Ml I和BamH I双酶切，以 Wizard PCR preps DNA Purification System 试剂盒纯化回收后用 T4DNA Lingase 进行连接，4°C过夜。连接产物按转化至DH (5 α)中，提取质粒进行酶切鉴定(见图幻，将筛选得到的阳性重组子命名为pET28a(+)-Hsp70C。对其进行核苷酸序列测定(见图3)，结果表明其基因序列和阅读框架正确。三、表达产物的SDS-PAGE分析将pEI^8a-Hsp70-C 转化 BL21 (DE3)，IPTG 诱导 3_4h，常规处理后，用 SDS-PAGE 分析，结果表明总蛋白中含目的蛋白(图4)，分子量大小均约为^kDa,与理论值相符，表明融合基因可在BL21(DE3)中实现表达。四、表达产物的Western blotting分析利用Western blotting，对 BL21 (DE3) (pED8a (+)-Hsp70_C)表达产物转膜后蛋白进行检测。结果表明，在约^kDa处出现识别条带，重组蛋白可以被His-Tag特异性抗体识别，而阴性对照在相同位置无条带(结果如图5所示)。五、表达产物与临床血清的杂交反应前期实验中，以绵羊传染性胸膜肺炎血凝抑制实验检本文档来自技高网...
【技术保护点】
１． 一种绵羊肺炎支原体Ｈｓｐ７０（ＤｎａＫ）Ｃ末端基因重组质粒，其构成方法为：首先设计并合成如下引物：Ｐ２： ＧＧＧＧＴＣＧＡＣＴＴＡＡＴＴＴＴＧＴＴＴＧＡＴＴＴＣ；Ｐ３： ＣＡＧＧＧＡＴＣＣＡＣＴＣＣＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＧＧ，再以质粒Ｔ－Ｈｓｐ７０为模板，利用上述引物Ｐ２、Ｐ３进行ＰＣＲ扩增，得到Ｈｓｐ７０ Ｃ末端基因ｃＤＮＡ片段，片段大小约为７００ ｂｐ，将该片段与ｐＥＴ２８ａ（＋）相连接，获得重组质粒ｐＥＴ２８ａ（＋）－Ｈｓｐ７０Ｃ，进一步将重组质粒转化至 ＢＬ２１（ＤＥ３）中，并对表达产物进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ，得到大小约为２９ ｋＤａ的目的蛋白。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王玉炯，李敏，谢琴，刘晓明，马春骥，徐庆春，
申请(专利权)人：宁夏大学，
类型：发明
国别省市：64
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