一种结核分枝杆菌的免疫学检测方法及其试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种结核分枝杆菌的免疫学检测方法及其试剂盒。该免疫学检测方法包括使用结核分枝杆菌特异性抗原，其中所述的结核分枝杆菌特异性抗原包括：蛋白38kDa，蛋白CFP10，以及糖抗原LAM和糖抗原TBGL中的一种或两种。本发明专利技术采用多抗原组合作为结核病抗体检测的混合抗原，灵敏度和特异性高，假阳性率低。在诊断的实际操作中由多点组合判断结果变为单点判断结果，操作更加方便，可特异地检测结核病患者血清、胸水等体液样品中抗体，只需半天时间。并且本试剂盒可大规模生产，成本相对较低。因此本发明专利技术对于结核病的控制具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医药体外诊断试剂领域，特别涉及一种结核分枝杆菌的免疫学检测方法及其试剂盒。
技术介绍
快速、准确的诊断结核分枝杆菌(MTB)感染，特别是菌阴结核的诊断，对于结核病的控制具有重要意义。MTB感染的诊断方法有很多，目前临床最为常用的方法仍然依靠传统的痰涂片细菌学检查，但检出率低；MTB培养可做为结核病确诊的“金标准”，但其培养时间太长，一般4-6周，难以满足临床需要；Bactec技术虽缩短了培养时间，但费用较高，短时间内难以推广普及；X线和CT检查仅提供影像学可能性诊断；聚合酶链反应(PCR)技术及其它基因诊断方法作为临床诊断尚存在操作复杂，对技术和人员专业素质要求较高，且仍不能用于菌阴结核病的快速诊断。而MTB感染的血清免疫学诊断以其固有的操作简便、快速、可用肉眼判断结果、稳定性好、便于推广、无需特殊精密仪器等优势，是新形势下最可能满足经济不发达地区和结核病高发区所亟需的结核病诊断技术。而现有的结核病免疫诊断产品多以单一抗原或少数建立在经验性基础的简单组合，均不能解决敏感性较低、特异性较差的问题。
技术实现思路
因此，本专利技术要解决的技术问题就是针对现有的结核分枝杆菌免疫检测方法存在的灵敏度和特异性差的不足，提供一种结核分枝杆菌的免疫学检测方法及其试剂盒，该方法灵敏度和特异性高，具有广泛应用前景。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案之一是一种结核分枝杆菌的免疫学检测方法，包括使用结核分枝杆菌特异性抗原，其中所述的结核分枝杆菌特异性抗原包括 蛋白38kDa，蛋白CFP10，以及糖抗原LAM和糖抗原TBGL中的一种或两种。本专利技术中，所述的蛋白38kDa，其序列在公共数据库NCBI GeneBank中的登录号是 (GI) :57116801(即Rv0934，GeneID :885724)。所述的蛋白CFP10，其序列在公共数据库 NCBI GeneBank 中的登录号是(GI) :15611010 (即 Rv3874，GeneID :886194。)所述的蛋白 38kDa、CFPlO都可以是从天然的结核分枝杆菌提取的蛋白，或者利用基因工程方法获得的重组蛋白。本专利技术中，所述的糖抗原LAM可以是常规的糖抗原LAM，较佳的由包括以下步骤的方法制备而得将灭活的结核分枝杆菌用水或缓冲溶液悬浮后破菌，离心取上清液；用等体积的酚/氯仿(1 1，ν/ν)抽提，取上清水相；用4倍体积的氯仿/甲醇O 1，ν/ν)抽提，取上清水相；加入DNase I和RNase，除去核酸；加入Triton-X 114，置4°C使其形成微胶粒，37°C水浴分层；抽提出上层不含去污剂的水相，加入Triton-X114，4°C过夜使其形成微胶粒，抽提有机相；下层含有去污剂的有机相中加入PBS，4°C处理使其形成微胶粒，37°C水浴后抽提有机相；将有机相合并后透析，冻干即得糖抗原LAM。糖抗原LAM的分子量在37. 5kDa处。本专利技术中，所述的糖抗原TBGL较佳的由包括以下步骤的方法制备而得将灭活的结核分枝杆菌用水或缓冲溶液悬浮后破菌；加入氯仿/甲醇(2 1，ν/ν)抽提出有机相，吹干；加入氯仿/甲醇/水G 2 1，ν/ν/ν)洗涤，取有机相；有机相吹干后溶于氯仿；过60 100目的硅胶柱，分别用氯仿、氯仿/甲醇(19 1，ν/ν)和氯仿/甲醇 (9 1，ν/ν)洗脱，收集氯仿/甲醇部分，冻干即得糖抗原TBGL。通过银染显色鉴定。本专利技术所述的结核分枝杆菌的免疫学检测方法，较佳的包括以下步骤1)用所述的结核分枝杆菌特异性抗原包被固相载体，2)加入稀释的待检样本，保温孵育，清洗除去任何未结合的成分，3)加入经标记的抗人抗体的第二抗体，保温孵育，清洗除去任何未结合的成分，4)检测孵育混合物中免疫结合复合物的存在。本专利技术中，步骤1)中所述的结核分枝杆菌特异性抗原对固相载体的包被浓度较佳的为糖抗原LAM为0. 2-8. 0μ g/ml，糖抗原TBGL为0. 1-2. 0 μ g/ml，蛋白38kDa为 0. 1-1. 0 μ g/ml，蛋白CFPlO为0. 5-4. 0 μ g/ml。更佳的，所述的结核分枝杆菌特异性抗原为组合 1，其中糖抗原 LAM，0. 5μ g/ml ；蛋白 38kDa，0. 8 μ g/ml ；蛋白 CFP10，0. 5 μ g/ml ；或者组合 2，其中糖抗原 TBGL，2y g/ml ；蛋白 38kDa, 1 μ g/ml ；蛋白 CFP10，0. 3 μ g/ml。所述的固相载体可以是本领域常用的固相载体，如玻璃、塑料等，较佳的是聚乙烯孔板，如96孔板寸。本专利技术中，步骤幻中所述的待检样本可以是来自待检人的血清、或者其它体液或组织标本，较佳的是来自待检人的血清。本专利技术中，步骤幻中所述的经标记的抗人抗体的第二抗体较佳的是辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体，也可以是其它标记的抗人其它抗体如IgM等的抗体。本专利技术中，所述的保温孵育的条件是常规的适合抗原抗体结合的条件，一般温度较佳的是15-50°C，时间为2分钟-5小时，最佳的是37°C，0. 5 2小时。本专利技术中，所述的清洗除去任何未结合的成分的方法是常规的方法，一般采用 PBST洗涤数次。本专利技术中，步骤4)中所述的检测孵育混合物中免疫结合复合物的存在的方法较佳的采用ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay ；酶联免疫吸附测定法)方法，也可以是其他的常规的检测方法。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案之二是一种结核分枝杆菌的免疫学检测试剂盒，包括结核分枝杆菌特异性抗原，其中，所述的结核分枝杆菌特异性抗原包括 蛋白38kDa，蛋白CFP10，以及糖抗原LAM和糖抗原TBGL中的一种或两种。本专利技术中，所述的试剂盒较佳的还包括经标记的抗人抗体的第二抗体。更佳的还包括任何以下的一种或多种包被液0. 05M的碳酸盐包被缓冲液(pH9. 6)；固相载体聚乙烯孔板；洗涤液PBST；经标记的抗人抗体的第二抗体过氧化物酶标记的抗人IgG抗体。稀释液含1 % BSA 的 PBST ；阳性对照血清或阴性对照血清；终止液2M硫酸；底物溶液底物缓冲液A 乙酸钠2. 4g，柠檬酸0. 28g溶于88ml超纯水，磁力搅拌器充分搅拌溶解，最后加入53 μ 1 30% H2O2，磁力搅拌器充分搅拌溶解而得；底物缓冲液B 80ml超纯水中加入0. 03g TMB和0. 32g EDTA_Na2，然后再加入8ml甘油，磁力搅拌使其充分搅拌溶解而得。本专利技术中，上述优选条件在符合本领域常识的基础上可任意组合，即得本专利技术各较佳实例。本专利技术所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。本专利技术除特别说明之外，所用的百分比都是重量百分比。本专利技术的积极进步效果在于a.本专利技术采用多抗原组合作为结核病抗体检测的混合抗原。从结核分枝杆菌复合群菌株中提纯制备糖抗原LAM和TBGL ；通过基因工程技术克隆、表达、纯化结核分枝杆菌重组蛋白(38kD、CFP10)；新提取的糖抗原LAM和TBGL具有结核分枝杆菌菌种和分枝杆菌菌属特异性，克隆表达的重组蛋白38kDa、CFPlO为RD缺失区编码，因而他们均能够保证较高的特异性，保证了诊断的灵敏度。b.本专利技术在混合抗原中，各单个抗原本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种结核分枝杆菌的免疫学检测方法，包括使用结核分枝杆菌特异性抗原，其特征在于，所述的结核分枝杆菌特异性抗原包括：蛋白３８ｋＤａ，蛋白ＣＦＰ１０，以及糖抗原ＬＡＭ和糖抗原ＴＢＧＬ中的一种或两种。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张舒林，孙战强，王洪海，
申请(专利权)人：张舒林，孙战强，王洪海，
类型：发明
国别省市：41