本发明专利技术公开了一种红毛藻中藻红蛋白的分离纯化方法。它利用膜技术在脱盐的同时去除小分子量杂蛋白，利用阴离子交换树脂对藻红蛋白的结合强度在不同盐浓度和不同pH值的溶液中有明显变化等原理达到将藻红蛋白和杂蛋白有效分离的效果，获得高纯度和高得率的藻红蛋白。不同组分中的藻红蛋白纯度多数高于3.2(一般公认标准)，最高为5.5，得率约为0.8g/100g红毛藻。本方法工艺简单，分离效果好，实现了对藻红蛋白的快速有效分离纯化。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术公开了一种藻红蛋白的提取方法，特别是涉及一种红毛藻中藻红蛋白的分离纯化方法。
技术介绍
藻红蛋白是许多海藻的重要捕光色素蛋白，它与藻蓝蛋白、异藻蓝蛋白等藻胆蛋白组成棒状的藻胆体，藻胆体能够捕获和传递光能。藻红蛋白主要分布在海藻的红藻中，由于色素分子的存在，它在可见光区480-570nm波段有较强的吸收，且可产生强烈的荧光。藻红蛋白可以作为天然色素应用于食品、化妆品、染料等行业，还可制成荧光试剂，用于临床医学诊断和免疫化学及生物工程等研究领域。藻红蛋白还是一种重要的生理活性物质，可制成光敏剂应用于肿瘤光动力学治疗。目前，藻红蛋白的分离纯化主要采用硫酸铵分级沉淀，离子交换柱层析，羟基磷灰石柱层析，凝胶过滤层析相结合的方法进行，分离纯化过程繁琐，操作复杂，耗时长，且成本高。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种工艺简单，分离效果好的红毛藻中藻红蛋白的分离纯化方法。本专利技术的工艺流程设计原理是在离子交换层析中，藻红蛋白对阴离子交换剂的结合力取决于彼此间相反电荷基团的静电吸引，而这种吸引力与溶液的PH值及盐浓度有关，因为PH值决定阴离子交换剂和蛋白质的电离程度，当pH值接近藻红蛋白的等电点(pi 约为3. 8)时，阴离子交换剂和蛋白质的相互作用减弱，蛋白质容易被洗脱下来；同时溶液中盐浓度的微小变化也会直接影响阴离子交换剂对蛋白质电荷的吸附容量。故本专利技术采用盐浓度线性梯度洗脱和PH值线性梯度洗脱相结合的洗脱方式对藻红蛋白进行纯化。本专利技术的具体步骤1、提取将红毛藻以1 20-25(m/v)比例溶于蒸馏水中，经过冻结-融解、搅拌、 组织捣碎、超声波破碎后，过滤、离心，上清液为粗提液。2、盐析在粗提液中加入一定量的硫酸铵，使得溶液达到35%硫酸铵饱和度，静置2小时，离心后弃沉淀。在上清液中加入硫酸铵至50%饱和度，静置2小时，离心后弃上清液，用0.02mol/L磷酸缓冲液(pH = 7.0)溶解沉淀，得盐析液。用30kDa分子量截留的超滤膜浓缩脱盐并去除分子量小于30kDa的杂蛋白。浓缩过程中适量加入磷酸缓冲液确保脱盐完全。3、吸附分离将脱盐后的藻红蛋白母液泵入填装有功能团为三乙基胺或四甲基胺的阴离子交换树脂吸附柱中，控制流速为lmL/min，吸附完毕后，用0. 02mol/L磷酸缓冲液 (pH = 5. 6，含0. 05mol/L NaCl)充分冲洗柱子至^Onm下的吸光度到基线。4、解吸吸附完成后的树脂经由相同体积的0.02mol/L磷酸缓冲液( !1 = 5.6，含 0. 05mol/L NaCl)和 0. 2mol/L NaH2PO4 溶液(含 0. 2mol/L NaCl)混合组成的线性梯度洗脱液淋洗解吸，收集洗脱液，多数洗脱液组分中藻红蛋白纯度(A565A28tl)高于3. 2，藻红蛋白得率约为0. 8g/100g红毛藻。5、树脂再生解吸后，树脂先用2mol/L NaCl溶液淋洗4小时，再将树脂拆下，在 0. lmol/L NaOH溶液中浸泡0. 5小时，然后用大量蒸馏水清洗树脂至近中性，树脂再生完毕，可循环使用。本专利技术通过进行具体的硫酸铵分级沉淀实验，获得最适合分离纯化红毛藻中藻红蛋白的硫酸铵分级沉淀饱和度(35%-50%)；解吸阴离子交换树脂时，通过使用混合梯度洗脱方式，即盐浓度线性梯度洗脱和PH值线性梯度洗脱相结合的方式，获得纯度大于3. 2 和得率为0.8% (相对于红毛藻干重)的藻红蛋白。本专利技术在硫酸铵盐析后，利用藻红蛋白分子量大Q40kDa)的特点，采用30kDa分子量截留的超滤膜浓缩脱盐。与耗时较长的透析脱盐相比，膜浓缩在实现快速脱盐的同时减少了样品体积，节省了离子交换柱的上样时间；去除了分子量小于30kDa的杂蛋白，显著提高了纯化效率。由于本专利技术利用阴离子交换树脂快速有效分离纯化红毛藻中的藻红蛋白，因而具有工艺简单，分离效果好的优点，大大简化了原来需要进行多次柱层析的纯化步骤。综上，本专利技术主要采用硫酸铵分级沉淀，膜技术处理脱盐除杂蛋白，进一步利用阴离子交换柱层析方法，快速有效地分离纯化红毛藻中的藻红蛋白。本专利技术采用了混合梯度洗脱的方式对吸附于阴离子交换柱的藻红蛋白进行洗脱，高效纯化了红毛藻中的藻红蛋白。本专利技术采用膜技术加快了脱盐速度并有效去除了低分子量杂蛋白。在阴离子交换柱洗脱方法上明显区别于以往的单一盐浓度梯度洗脱或单一 PH值梯度洗脱方式，获得了纯度大于3.2(—般公认标准)和得率为0.8% (相对于红毛藻干重)的藻红蛋白。附图说明图1为纯化后的藻红蛋白的光谱图；图2为纯化藻红蛋白的SDS-PAGE电泳图。M，标准蛋白；泳道1，藻红蛋白粗提物；泳道2，35-50%硫酸铵盐析组分；泳道3， DEAE-Sepharose柱纯化藻红蛋白，电泳胶为银染色。具体实施例方式实施例11、提取取IOOmL蒸馏水溶胀5g红毛藻粉末，经冻融后，加入200mL蒸馏水进行搅拌、组织捣碎、超声波破碎，然后过滤、离心，收集上清液约300mL，即为藻红蛋白粗提液。2、盐析向300mL粗提液中加入58. 20g固体硫酸铵，使得溶液达到35%硫酸铵饱和度，静置2小时，离心弃沉淀。在上清液中加入29. 14g硫酸铵至50%饱和度，静置2小时，离心后弃上清液，用0.02mol/L磷酸缓冲液(pH = 7.0)溶解沉淀，体积约为100mL。进一步利用30kDa分子量截留的超滤膜浓缩脱盐并去除分子量小于30kDa的杂蛋白。浓缩过程中适量加入磷酸缓冲液确保脱盐完全。3、吸附分离将脱盐后的藻红蛋白母液泵入填装有DEAE-kpharose Fast Flow阴离子交换树脂的吸附柱(2. 5X6cm)中，流速lmL/min，吸附完毕后，用0. 02mol/L磷酸缓冲液(pH = 5. 6，含0. 05mol/L NaCl)冲洗柱子6小时。4、解吸吸附完成后的树脂经由120mL 0. 02mol/L磷酸缓冲液(pH = 5. 6，含 0. 05mol/LNaCl)和 120mL 0. 2mol/L NaH2P04 溶液(含 0. 2mol/L NaCl)混合组成的线性梯度洗脱液淋洗解吸，收集洗脱液OmL/管)，多数洗脱液组分中藻红蛋白纯度(A565/A^0) 高于3. 2，最高为5. 5，藻红蛋白得率为0. 785g/100g红毛藻。纯化后藻红蛋白的可见光光谱特征与文献报道基本一致，见图1。已知红藻中的藻红蛋白常态下是以(α β)6γ的形式存在，本实施例藻红蛋白经过2-巯基乙醇处理后，进行SDS-PAGE及银染色分析，结果如图2所示，在分子量为21. 5kDa 处的蛋白条带是藻红蛋白的α和β亚基，因两者的相对分子质量相当接近，所以出现了部分重叠现象。α亚基的相对分子质量约为19kDa，β亚基的相对分子质量约为21kDa，而、 亚基的相对分子质量约为27kDa。因而，本专利技术的电泳图说明藻红蛋白与报道的一致。5、树脂再生解吸后，树脂用2mol/L NaCl溶液淋洗4小时，再将树脂拆下，在 0. lmol/L NaOH溶液中浸泡0.5小时，然后用大量蒸馏水清洗树脂至近中性，树脂再生完毕，可循环使用。实施例21、提取取200mL蒸馏水溶胀IOg红毛藻粉末，经冻融后，加入550mL蒸馏水进行搅拌、组织捣碎、超声波破碎，然后过滤、本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种红毛藻中藻红蛋白的分离纯化方法，包括如下步骤：（１）提取：将红毛藻以１∶２０－２５ｍ／ｖ比例溶于蒸馏水中，经过冻结－融解、搅拌、组织捣碎、超声波破碎后，过滤、离心，上清液为粗提液；（２）盐析：向步骤（１）所得的藻红蛋白粗提取液中加入硫酸铵至其饱和度为３５％－５０％盐析，离心，收集沉淀并用磷酸缓冲液（Ｋ２ＨＰＯ４－ＮａＨ２ＰＯ４）溶解，得盐析液，然后用３０ｋＤａ分子量截留的超滤膜浓缩脱盐并去除分子量小于３０ｋＤａ的杂蛋白；（３）吸附分离解吸：脱盐后的浓缩液经阴离子交换树脂吸附分离，藻红蛋白吸附在树脂上，吸附后的树脂经混合梯度的磷酸缓冲液淋洗解吸藻红蛋白，得到藻红蛋白。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：曹敏杰，付晓苹，刘光明，苏文金，
申请(专利权)人：曹敏杰，
类型：发明
国别省市：92
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