本发明专利技术公布了一种蓝藻工程菌及其制备方法和应用。所述蓝藻工程菌为cesA基因缺失的蓝藻(Synechococcus?sp.)PCC?7002突变体；该突变体的质粒或基因组上整合有木醋杆菌(Gluconacetobacter?xylinum)ATCC?53582的7个纤维素合成相关基因cmcase、ccp、acsA、acsB、acsC、acsD、bglxA；所述7个基因由蓝藻(Synechococcus?sp.)PCC?7002或蓝藻(Synechocystis?sp.)PCC?6803的cpcBA基因的启动子PcpcBA来启动表达。该工程菌纤维素含量占细胞壁干重的13％左右，同时，该蓝藻工程菌生产纤维素的生长周期短，而且不存在木材中的木质素的污染问题，其提取和纯化过程可以大大简化，并且对环境的污染程度也可以相应的大大减少，是一种理想的生产纤维素的生物工程菌，进而作为生产生物乙醇的原料。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及一种纤维素高产的蓝藻工程菌及其制备方法和应用。
技术介绍
近年来受能源危机的影响，世界各国都在积极探索各种形式的新能源，以此替代有限的化石能源(煤，石油，天然气)。生物能源作为新能源的代表，正在发挥着越来越大的作用。目前生物能源主要包含生物乙醇，生物柴油，生物气体三大类。乙醇不仅是一种重要的化工原料，同时也是一种高效低污染的石油替代型能源，所以其重要性不言而喻。现有的乙醇生产平台主要依靠淀粉和糖类物质以及玉米杆和麦秆等纤维素材质的发酵与分解。例如美国近年来利用玉米大量生产乙醇，而巴西凭借其地理位置的优势大面积耕种甘蔗进而分解为乙醇，使其以燃料乙醇为代表的生物能源产业的发展受到了全世界瞩目。尽管美国具有玉米生产乙醇的技术平台优势，但这严重占用了现有耕地，与食物的供应产生了冲突；而巴西有地理位置的优势，可以大面积耕种甘蔗，但这种策略并不适用于其他不具备此地理环境的国家。而最为传统的依靠降解玉米杆和麦秆等植物的纤维素以生产乙醇的方式，因为其中大量木质素难以被去除，导致生产过程具有低效率，高能耗和高污染的缺点。因此需要寻求技术上的突破来探索其他生产乙醇的方式，一方面不占用耕地， 另一方面降低生产成本，同时还应当减少环境的污染。蓝藻作为一种能够光合自养的微生物，其低廉的培养成本，高效的生长速率以及特殊的细胞结构，为其作为产生生物能源的工程菌提供了很大潜力。而木醋杆菌 Gluconacetobacter xylinum ATCC 5；3582是一种可以天然向胞外分泌结晶型纤维素(I 型)的细菌。其分泌的纤维素已经广泛应用于医疗，食品，制造业等各个领域。但培养木醋杆菌的高额成本和生长过程中产生的次级代谢物以及废弃物对环境的污染，使其不适于进行大规模的培养生产。若单纯用其分泌的纤维素降解为乙醇作为能源，这样需要更高昂的代价。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种纤维素高产、培养成本低的蓝藻工程菌。本专利技术提供的技术方案如下1. 一种蓝藻工程菌，其特征在于，所述工程菌为cesA基因(SEQ ID N0:1)缺失的蓝藻(Synechococcus sp. )PCC 7002突变体；该突变体的质粒或基因组上整合并表达木醋杆菌(Gluconacetobacter xylinum)ATCC 53582的7个连续的纤维素合成相关基因 cmcase (SEQ ID NO :4)、ccp (SEQ ID NO :5)、acsA (SEQ ID NO :6)、acsB (SEQ ID NO :7)、 acsC(SEQ ID NO :8)、acsD(SEQ ID NO :9)、bglxA (SEQ ID NO :10)；2.如方案1所述的蓝藻工程菌，其特征在于，所述7个连续的纤维素合成相关基因由蓝藻(Synechococcus sp. )PCC 7002的cpcBA基因的启动子(SEQ ID NO 11)或蓝藻(Synechocystis sp. )PCC 6803 的 cpcBA 基因的启动子(SEQ ID NO 12)来启动表达。3.如方案1所述的蓝藻工程菌，其特征在于，所述7个连续的纤维素合成相关基因整合到蓝藻的质粒为pAQl、pAQ3、pAQ4、pAQ5、pAQ6、pAQ7之一上，或整合到蓝藻基因组上。4.方案1所述蓝藻工程菌的制备方法，其特征在于，包括如下步骤1)将蓝藻(Synechococcus sp.)PCC 7002 自身的纤维素合成基因 cesA(SEQ ID NO 1)敲除或破坏，得到蓝藻突变体；2)构建Ql载体，所述载体上含有红霉素抗性基因(Em)，载体序列中含有2段与蓝藻(Synechococcus sp.)PCC 7002的质粒pAQl同源的DNA区域，分别是图4中的 5，Homologous Region(SEQ ID NO :13)和 3，Homologous Region(SEQ ID NO :14)；3)将木醋杆菌(Gluconacetobacter xylinum)ATCC 5；3582 基因组中的连续 7 个纤维素合成相关基因 cmcase(SEQ ID NO :4)、ccp (SEQ ID NO :5)、acsA (SEQ ID NO :6)、 acsB(SEQ ID NO :7)、acsC (SEQ ID NO :8)、acsD (SEQ ID NO 9)和 bglxA(SEQ ID NO :10) 进行PCR扩增，得到长度约14. 5Kb的片段，将所述片段连到上一步构建的Ql载体上，这7 个连续基因的表达均受控于连在Ql载体上的蓝藻(Synechococcus sp. )PCC 7002的cpcBA 基因的启动子(SEQ ID NO 11)或蓝藻(Synechocystis sp. )PCC 6803的cpcBA基因的启动子(SEQ ID NO :12)(图 4)；4)将上一步得到的Ql载体转化至第1)步产生的蓝藻突变体中，即得到了所需的蓝藻工程菌。5.如方案4所述的制备方法，其特征在于，第1)步中，用同源双交换的方法敲除所述蓝藻的cesA基因。6. 一种生产纤维素的方法，其特征在于，包括如下步骤a)用方案4所述的方法制备出蓝藻工程菌；b)将所得的工程菌培养在A+培养基中约1周时间，使工程菌生长到OD值达到 1. 0 2. 0 ；c)将所述工程菌离心富集，转移到适合于蓝藻生长的淡水培养基BGll中约2周；d)从所述工程菌提取纤维素。7.如方案6所述的生产纤维素的方法，其特征在于，在所述A+培养基和BGll培养基的培养过程中始终进行吹气培养，气体成分为空气占98% 99%，CO2占1% 2% ；培养过程始终保证温度25°C :35°C，光照强度30 μ E/m2s 300 μ E/m2s。8.方案1所述蓝藻工程菌在生产纤维素方面的应用。9.如方案8所述应用，其特征在于，所述纤维素用于生产乙醇，进而用作生物能源。经检测，野生型蓝藻Synechococcus sp. PCC 7002的纤维素含量占细胞壁干重的质量百分比约为2%，而本专利技术构建的蓝藻工程菌，纤维素含量可以达到自身细胞壁干重的约13%，同时，该蓝藻工程菌生产纤维素的生长周期短(总共约3周时间)，而且不存在木材中的木质素的污染问题，其提取和纯化过程可以大大简化，并且对环境的污染程度也可以相应的大大减少，是一种理想的生产纤维素的生物工程菌。附图说明图 1 (a)野生型 Synechococcus sp. PCC 7002 ； (b)Synechococcus sp. PCC 7002cesA缺失突变体。图 2 (a)野生型 Synechococcus sp. PCC 7002 ； (b) Synechococcus sp. PCC 7002 蓝藻工程菌。图3实施例的葡萄糖标准曲线。图4本专利技术构建的Ql载体质粒图。具体实施例方式1.首先，通过生物学中常用的“同源双交换”的方法将蓝藻Synechococcus sp. PCC 7002自身的纤维素合成基因cesA(SEQ ID NO 1)敲除(同源双交换，也就是在需要敲除的目的基因5，和3，两端各选取一段长度适宜的DNA片段，一般从400bp至3Kb均可。在本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种蓝藻工程菌，其特征在于，所述工程菌为ｃｅｓＡ基因（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）缺失的蓝藻（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）ＰＣＣ ７００２突变体；该突变体的质粒或基因组上整合并表达木醋杆菌（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕｍ）ＡＴＣＣ ５３５８２的７个连续的纤维素合成相关基因ｃｍｃａｓｅ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、ｃｃｐ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）、ａｃｓＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）、ａｃｓＢ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）、ａｃｓＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）、ａｃｓＤ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）、ｂｇｌｘＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：赵进东，赵驰，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：11
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