抗体与诊断试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了针对一种肿瘤抑制蛋白特定区域的新抗体。以抗体为基础，本发明专利技术还提供了用来区分乳腺癌或卵巢癌具体类型的诊断方法和试剂。

【技术实现步骤摘要】
抗体与诊断试剂盒
本专利技术主要涉及诊断试剂以及利用试剂盒诊断疾病的方法，特别是利用抗体及包含抗体的试剂盒诊断遗传性的乳腺癌和卵巢癌。技术背景乳腺癌是女性人群中发病率最高的恶性肿瘤。在美国，每年有超过二十万的女性被诊断患有乳腺癌，在欧洲和中国，每年确诊患有乳腺癌的人数也都在这一水平之上，全世界每年死于乳腺癌的人数超过五十万。然而，如果能够尽早诊断发现，乳腺癌病情的预后发展还是相当令人乐观的。例如，在第IV期才得到诊断的乳腺癌患者只有约20％能够活到5年之后，而在第I期就确诊的患者几乎能百分之百地活到5年之后。相比之下，尽管卵巢癌的发病几率小得多，但它却是致死率最高的癌症之一，确诊后能生存5年以上患者少于50％。但是这很大程度上是由于卵巢癌不能得到及时的诊断所致，因为高达75％的卵巢癌病例是在癌组织已经扩散后才被诊断出来的。大约有10％的乳腺癌和卵巢癌是由遗传性的BRCA1和BRCA2基因突变引发的。携带有这些突变基因的女性在70岁之前得乳腺癌或卵巢癌的几率分别可高达85％和55％。在最近的十年里，发达国家已经能够对女性BRCA1和BRCA2突变基因的携带者进行乳腺癌和卵巢癌的易感性基因检测。一旦发现有这类突变基因，就需要加强病情的日常监测(包括乳房X光片、核磁共振、CA-125筛查等)，以期能够尽早诊断是否有恶性肿瘤发生，从而使病情有良好的预后发展。另外，伴随有BRCA1和BRCA2基因突变的肿瘤与其他肿瘤有着十分不同的表现型，特别地，能引起DNA损伤的化学治疗(如铂类抗癌药物)以及放射治疗方法对前者有很好的效果，但微管蛋白抑制剂(如紫杉醇类)则对其没有很显著的效果。此外，人们正在研发一类新的特异性针对BRCA1和BRCA2基因缺陷型癌症的药物——PARP抑制剂，而这类药物的使用通常要求先对病人进行BRCA1和BRCA2基因突变的检测。现行的BRCA1和BRCA2基因的遗传检测通常是在分子水平上对基因组DNA进行复杂的分析，需要投入大量的劳力，成本很高。这样的高成本对于发展中国家来说几乎是无法克服的壁垒，而技术的复杂性也使得普通医院的实验室都不能进行这种检测。相比之下，基于抗体的BRCA基因突变检测技术是一种更为廉价的方法。美国专利编号为5,965,377的技术专利技术就提供了一种这样的方法：利用BRCA1或BRCA2蛋白N端和C端的特异性抗体检测BRCA蛋白是否存在截断变异，抗体不能与C末端特异性结合就表明蛋白质存在截断突变。然而，这种检测方法的特异性和灵敏度都不高。Kashima等人研究了家族性卵巢癌(Jpn.J.CancerRes.，91：399-409(2000))，利用对BRCA1蛋白的免疫组化染色检验了这种方法，他们发现有时候在肿瘤样品包含突变时C末端抗体也会着色，我们不得不进一步仔细考察抗体着色的亚细胞定位才能据此确定BRCA1基因变异的状态。因而，现行的检测方法尚未能满足我们所期望的高精确度和低成本的要求。
技术实现思路
本专利技术通过构建新的特异性抗体为BRCA1变异的检测提供了一种更加简易方便的方法。这种方法有着精确度高，操作简易以及成本低的特点。特别地，本专利技术提供并利用一种独立抗体，能够选择性地与人类BRCA1基因的第11个外显子编码的多肽片段C端发生免疫反应。这种抗体对于检测BRCA1基因的第11个外显子突变尤其有效。将这种抗体与人类BRCA1蛋白的C端抗体联合使用，就构成了能够检测乳腺癌或卵巢癌肿瘤样品中几乎所有类型的BRCA1蛋白截断变异的诊断试剂盒。在一般的实施方案中，这种抗体能选择性地与含有如序列编号1(SEQIDNO：1)所示氨基酸序列的多肽发生免疫反应。在优选的实施方案中，这种抗体是用含有序列编号1(SEQIDNO：1)中至少6个连续氨基酸的抗原免疫动物所得到的。在优选的实施方案中，这种抗体为单克隆抗体。另外，本专利技术还包括用来产生这种抗体的动物以及杂交瘤细胞。另一方面，本专利技术也提供了这种抗体用途，用于制备诊断试剂盒以检测病人肿瘤样品中BRCA1的截断突变。在优选的实施方案中，本专利技术提供了使用：(1)本专利技术中的抗体，(2)选择性与人类BRCA1蛋白N端发生免疫反应的抗体，以及(3)选择性与人类BRCA1蛋白C端发生免疫反应的抗体，用于制备诊断BRCA1基因截断突变的试剂盒，特别是针对乳腺癌或卵巢癌的肿瘤样品。本专利技术的试剂盒同时还提供独立分装的容器，其中包含：(1)针对人类BRCA1基因的第11个外显子编码的多肽的C端的特异性抗体，以及(2)选择性与人类BRCA1蛋白C端发生免疫反应的抗体。在一些优选方案中，试剂盒还包含能够选择性与人类BRCA2蛋白C端发生免疫反应的抗体。另外，本专利技术的试剂盒还可以同时包含与人类BRCA1蛋白N端特异发生免疫反应的抗体和/或与人类BRCA2蛋白N端特异发生免疫反应的抗体。除了以上所述之外，本专利技术还提供了检测肿瘤样品中BRCA1蛋白截断突变的方法，包括：(1)用本专利技术中特异性地针对BRCA1基因第11个外显子编码的多肽片段C端的抗体与肿瘤样品接触，并测定其与样品的结合情况；以及(2)用选择性地与人类BRCA1蛋白C端发生免疫反应的抗体与肿瘤样品接触，并测定其与样品的结合状况。在这种检测操作方法下，如果样品中的BRCA1蛋白与针对BRCA1基因第11个外显子编码的多肽片段C端的抗体和针对BRCA1蛋白C端的抗体这两种抗体都不结合，就表明样品中BRCA1基因在第11个外显子的上游区域发生了截断突变。如果检测到肿瘤样品中BRCA1蛋白和针对BRCA1蛋白C端的抗体的结合能力减弱或不能结合，但却和针对BRCA1基因第11个外显子编码的多肽片段C端的抗体正常结合，就表明BRCA1基因在第11个外显子的下游区域发生了截断突变。如果检测到样品中的BRCA1蛋白与针对BRCA1基因第11个外显子编码的多肽片段C端的抗体结合能力减弱或缺失，但却与针对BRCA1蛋白C端的抗体正常结合，就表明第11个外显子区域发生了截断突变。而如果针对BRCA1基因第11个外显子编码的多肽片段C端的抗体和针对BRCA1蛋白C端的抗体都与样品正常结合，则表明BRCA1基因没有发生截断突变。前面已经提到的和其他还没有提及的本专利技术的优点和特征，以及它们所实现的方式，都将在下面的专利技术详述中给予清楚地说明。另外，专利技术详述中还将结合具体例子阐释优选及典型的实施方案。附图说明图1是用不同的BRCA1抗体进行免疫反应试验的示意图，据此可以判定造成蛋白截断的BRCA1基因的突变位点所在；图2是杂交瘤细胞克隆BZ-98的上清液对MCF-7细胞裂解物进行的蛋白质印迹检测(WesternBlot)的图象。具体实施方式本专利技术利用一种新设计的特异性抗体对BRCA1蛋白的截断突变进行检测，具有精确度高，操作简易和成本低的特点。新设计的抗体能够特异性地与人类BRCA1基因第11外显子编码的多肽片段的C端发生免疫反应，即该抗体能够识别从该多肽链C末端起300个氨基酸残基之内的表位(以下简称这抗体为“第11外显子抗体”)。在优选的实施方案中，这一表位定位在距多肽链C末端200个或100个氨基酸残基之内的位点。最优的情况是，这一抗体特异性地与第11外显子编码的多肽链C端50个氨基酸残基顺序发生免疫反应，也就是说本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种经纯化的抗体，能够选择性与含有如序列编号１或２所示的氨基酸序列的多肽发生免疫反应。

【技术特征摘要】
2010.05.12 US 61/333,7521.一种经纯化的能够选择性与如序列编号1或2所示的氨基酸序列的多肽发生免疫反应的抗体联合一种选择性与人类BRC...

【专利技术属性】
技术研发人员：祝建，
申请(专利权)人：湖州数问生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：33