靶多核苷酸的扩增效率的调节方法技术

本发明专利技术提供：使用下述(i)～(iii)的引物，通过PCR扩增靶多核苷酸时，调节该靶多核苷酸的扩增效率的方法，该方法包括：通过调节下述(i)～(iii)的引物的量比，来调节靶多核苷酸的扩增效率。(i)第1引物，其与靶多核苷酸结合；(ii)第2引物，其与第1引物竞争地与靶多核苷酸结合，但与第1引物相比不易发生PCR的伸长反应；(iii)第3引物，其与第1引物形成对、且被设计成可以扩增靶多核苷酸。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及调节靶多核苷酸的扩增效率的方法、以及调节靶多核苷酸的检测效率的方法、使用该方法的靶多核苷酸的检测方法。本专利技术还涉及疾病的试验方法和诊断方法。 此外，本专利技术还涉及用于扩增靶多核苷酸的引物组合的制造方法、用于检测靶多核苷酸的试剂盒的制造方法。
技术介绍
等位基因特异性PCR 法(ASP-PCR 法(Allele Specific Primer-PCR 法))是用于检测SWs等的突变的方法。典型的等位基因特异性PCR法是以组合的形式使用3’末端具有与突变等位基因特异性核苷酸对应的核苷酸的引物和与该引物形成对以扩增包含SNP 位点的区的引物，通过特异性地扩增包含突变等位基因的靶多核苷酸，来检测突变等位基因(日本专利第2853864号公报)。但是，在上述的等位基因特异性PCR法中，为了特异性地扩增包含突变等位基因的靶多核苷酸，必需设定严格的PCR条件，因此存在着难以得到高的检测灵敏度的问题(日本特开2010-35532号公报)。作为解决上述问题的技术，已知有作为典型的等位基因特异性PCR法的应用技术的核酸扩增方法，其特征在于，使用下述(i) (iii)的引物进行上述靶核酸的PCR反应: (i)第1正向引物，该引物除了只在从3’末端数起第2碱基和第3碱基的其中一方中具有作为上述SNP位点的野生型核苷酸以外，还具有与包含上述靶核酸内的SNP位点的部分区同源的核苷酸序列；(ii)第2正向引物，该引物除了只在从3’末端数起第2碱基和第3碱基的其中一方中具有作为上述SNP位点的突变型核苷酸以外，还具有与包含上述靶核酸内的SNP位点的部分区同源的核苷酸序列；(iii)反向引物，该引物在上述靶核酸的互补链的、上述SNP位点的5’末端侧具有与不包含上述SNP位点所对应的位点的部分区同源的核苷酸序列(日本特开2010-35532号公报)。
技术实现思路
然而，通过检测基因中存在或不存在突变，来测定该突变所关联的疾病的可能性时，出于得到可用于疾病的诊断的有意义的检测结果的目的，必需分析各种检测灵敏度下的上述突变的检测结果和与该突变所关联的疾病有关的临床所见的关系，确定用于进行可用于诊断的检测的检测灵敏度的基准。作为用于调节检测灵敏度的途径，通常认为是通过根据作为检测目标的突变设法进行引物的设计，调节包含突变等位基因的靶多核苷酸的扩增效率。但是，在这样的途径中，必需反复进行引物的设计、引物的制作、确认扩增效率的工作，往往需要很大的劳力。于是，本专利技术的课题在于在扩增靶多核苷酸的技术中，提供简便地调节靶多核苷酸的扩增效率的技术。作为解决上述课题的方法，本专利技术提供在使用下述(i) (iii)的引物通过PCR扩增靶多核苷酸时，调节该靶多核苷酸的扩增效率的方法，该方法包括通过调节下述 (i) (iii)的引物的量比，来调节靶多核苷酸的扩增效率。各引物如下。⑴第1引物，其与靶多核苷酸结合(对合)；(ii)第2引物，其与第1引物竞争地与靶多核苷酸结合，但与第1引物相比不易发生PCR的伸长反应；(iii)第3引物，其与第1引物形成对、且被设计成可以扩增靶多核苷酸。利用上述方法，可以简便地调节靶多核苷酸的扩增效率。作为上述引物的量比，可以列举第3引物的量相对第1引物和第2引物的总量、 第1引物的量相对第2引物的量。通过如此地调节引物的量比，可以简便地调节靶多核苷酸的扩增效率。本专利技术还提供使用上述⑴ (iii)的引物，通过PCR扩增靶多核苷酸，再使用所得的扩增产物检测该靶多核苷酸时，调节该靶多核苷酸的检测效率(检测灵敏度)的方法，该方法通过利用本专利技术的扩增效率的调节方法，来调节该靶多核苷酸的检测效率(检测灵敏度)。利用上述方法，可以简便地调节靶多核苷酸的检测效率。本专利技术还提供靶多核苷酸的检测方法，该方法包括利用上述方法调节靶多核苷酸的检测效率，使用实现所调节的检测效率的量比的上述(i) (iii)的引物进行PCR，检测所得的PCR扩增产物中的靶多核苷酸。利用上述检测方法，可以以适当的检测灵敏度简便地进行靶多核苷酸的检测。本专利技术还提供试验方法，该方法包括使用上述检测方法检测来自受检者的基因中存在或不存在突变，将得到的检测结果与检测该突变时上述受检者有可能具有由该突变的存在引起的疾病的基准进行比较，从而试验由于存在上述突变而引起的疾病的可能性。利用上述试验方法，可以降低得到临床上意义小的试验结果的可能性。本专利技术还提供药效的预测方法，该方法包括使用上述检测方法检测在来自受检者的基因中存在或不存在突变，通过比较所得的检测结果和该突变是否存在以及特定的药物的效果的关系，预测上述特定的药物对上述受检者的效果。利用上述药效的预测方法，可以在给药时预测药效，期待可以进行有效的给药。并且，本专利技术提供疾病的诊断方法，该方法包括根据利用上述试验方法得到的试验结果来诊断疾病。利用上述诊断方法，可以降低得到不适当的诊断结果的可能性。本专利技术还提供引物组合的制造方法，所述引物组合用于通过PCR扩增或检测靶多核苷酸。该制造方法包括使用上述方法调节靶多核苷酸的扩增效率，组合实现所调节的扩增效率的量比的上述(i) (iii)的引物。利用上述制造方法，可以简便地制造实现靶多核苷酸的任意的扩增效率、检测效率的引物组合。本专利技术还提供检测试剂盒的制造方法，所述检测试剂盒用于利用PCR检测靶多核苷酸。该制造方法包括使用上述方法调节靶多核苷酸的扩增效率，之后组合实现所调节的扩增效率的量比的上述(i) (iii)的引物和探针，所述探针包含与靶多核苷酸互补的序列，末端用荧光色素标记，且杂交时荧光增加或减少。利用上述制造方法，可以简便地制造实现靶多核苷酸的任意的检测效率的检测试剂盒。本专利技术还提供引物组合，该引物组合包含上述⑴ (iii)的引物，且第3引物的量相对第1引物和第2引物的总量以摩尔比计大于1倍。本专利技术还提供引物组合，该引物组合包含上述⑴ (iii)的引物，且第3引物的量相对第1引物和第2引物的总量以摩尔比计小于1倍。专利技术效果本专利技术可以简便地调节靶多核苷酸的扩增效率。本专利技术还可以简便地调节靶多核苷酸的检测效率(检测灵敏度)。通过适当设定靶多核苷酸的检测灵敏度，期待着可以使靶多核苷酸所关联的疾病的可能性的测定、疾病的诊断更准确。附图说明图1显示第1引物和第2引物的总量与第3引物的量比对突变型质粒(靶多核苷酸)的检测灵敏度的影响。图2是显示第1引物和第2引物的总量与第3引物的量比对突变型质粒(靶多核苷酸)的检测灵敏度的影响的图。图3是显示第1引物与第2引物的量比对突变型质粒(靶多核苷酸)的检测灵敏度的影响的图。图4是显示第1引物与第2引物的量比对突变型质粒(靶多核苷酸)的检测灵敏度的影响的图。图5A是显示第1引物和第2引物的总量与第3引物的量比对突变型质粒(靶多核苷酸)的检测灵敏度的影响的图。量比(R/(Fwt+Fmt))以摩尔比计为1倍。图5B是显示第1引物和第2引物的总量与第3引物的量比对突变型质粒(靶多核苷酸)的检测灵敏度的影响的图。量比(R/(Fwt+Fmt))以摩尔比计为2倍。图5C是显示第1引物和第2引物的总量与第3引物的量比对突变型质粒(靶多核苷酸)的检测灵敏度的影响的图。量比(R/(Fwt+Fmt))以摩尔比计为4倍。图5D是显示第1引物和第2引物的总量与第3引物本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．调节靶多核苷酸的扩增效率的方法，该方法是在使用下述（ｉ）～（ｉｉｉ）的引物通过ＰＣＲ扩增靶多核苷酸时，调节该靶多核苷酸的扩增效率，该方法包括：通过调节下述（ｉ）～（ｉｉｉ）的引物的量比，来调节靶多核苷酸的扩增效率，（ｉ）第１引物，其与靶多核苷酸结合；（ｉｉ）第２引物，其与第１引物竞争地与靶多核苷酸结合，但与第１引物相比不易发生ＰＣＲ的伸长反应；（ｉｉｉ）第３引物，其与第１引物形成对、且被设计成可以扩增靶多核苷酸。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：小森真理子，
申请(专利权)人：爱科来株式会社，
类型：发明
国别省市：JP