本发明专利技术提供了L-谷氨酸的发酵方法，其包括：将表达RNA聚合酶sigma-32因子变体的工程菌接入第一发酵罐培养并将获得的培养液接种于第二发酵罐培养，将所得的培养液接种量接种于第三发酵罐培养，然后在分阶段变温的条件下向第三发酵罐持续流加糖和氮源。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于氨基酸发酵领域，具体而言，本专利技术涉及发酵L-谷氨酸的方法，其包括将表达RNA聚合酶sigma-32因子变体的工程菌接入第一发酵罐培养并将获得的培养液接种于第二发酵罐培养，将所得的培养液接种量接种于第三发酵罐培养，然后在分阶段变温的条件下向第三发酵罐持续流加糖和氮源。另外，本专利技术还提供了所述方法生产的产品等。
技术介绍
L-谷氨酸是重要的氨基酸原料，已经被广泛用作为调味品和食品添加剂使用。当前，L-谷氨酸的生产主要是通过微生物的发酵生产的，如可以利用棒状杆菌来生产。用于发酵生产的微生物可以是野生型微生物，但是更多的是通过诱变或基因工程获得的产量更高的营养缺陷型、耐药变异型和代谢变异型微生物。对于基因工程获得的性状改良的微生物来说，其中至关重要的就是性质优异的基因。热休克(heat shock)是生物体的一种重要的自我修复机制，在面对高温、高渗透压、毒物等情况下采取的防御机制。其中，RNA聚合酶sigma-32因子通过特异性地对热休克启动子起作用，而参与热休克过程，影响热休克相关蛋白的转录，从而对氨基酸(如，谷氨酸)发酵中的微生物克服代谢产生的毒物产生影响。尽管野生型RNA聚合酶sigma-32已经被公开(可参见NCBI (http //www. ncbi. nlm. nih. gov)蛋白和基因登录号AAB18436. 1 ； 也可参见中国专利申请第96193336号)，但是对聚合酶sigma-32的变体的研究却没有报道。本专利技术人经过长期艰苦研究，除了令人意外地发现了新的RNA聚合酶sigma-32因子之外，本专利技术人更详细地研究了适合含有该酶的工程菌发酵的方法，尤其是分级变温发酵，在实际生产中增加了谷氨酸的产量。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题在于提供新的发酵L-谷氨酸的方法，其包括将表达RNA 聚合酶sigma-32因子变体的工程菌接入第一发酵罐培养并将获得的培养液接种于第二发酵罐培养，将所得的培养液接种量接种于第三发酵罐培养，然后在分阶段变温的条件下向第三发酵罐持续流加糖和氮源。另外，本专利技术还提供了所述方法生产的产品等。具体而言，在第一方面，本专利技术提供了发酵L-谷氨酸的方法，其包括(1)将表达RNA聚合酶sigma-32因子变体的工程菌接入第一发酵罐于34_36°C培养6-10小时；(2)将步骤(1)获得的培养液以3-7% (体积)的接种量接种于第二发酵罐，于 34-36°C培养8-12小时;(3)将步骤(2)获得的培养液以10-20% (体积)的接种量接种于第三发酵罐，于 31-34 °C培养2-4小时；(4)向第三发酵罐持续流加糖和氮源，其中糖的每小时流加量为第三发酵罐内培养液量的0. 2-0. 35% (重量)，而且氮源的每小时流加量为第三发酵罐内培养液量的 0. 1-0. 25% (重量)，于 35-36°C培养 11-17 小时；和(5)向第三发酵罐持续流加糖和氮源，其中糖的每小时流加量为第三发酵罐内培养液量的0. 35-0.6% (重量)，而且氮源的每小时流加量为第三发酵罐内培养液量的 0. 05-0. 12% (重量)，于 38-39°C培养 10-18 小时。在本文中，“第一”、“第二”和“第三”在修饰发酵罐的时候，是为了区分所修饰的发酵罐，即第一发酵罐、第二发酵罐和第三发酵罐之间是互不相同的。在本文中，接种量具有本领域技术人员所能常规理解的含义，具体在以体积百分比表示的时候，指的是菌体培养液(接入的菌液)体积相对于被接入的培养基体积的百分比量。第一发酵罐和第二发酵罐中的培养基配方可以是相同的，也可以是不同的，优选是相同的。优选在本专利技术第一方面的方法中，第一发酵罐和第二发酵罐中的培养基配方为 每18立方米培养基中含，葡萄糖500-800公斤，甘蔗糖蜜50-300公斤，玉米浆400-700公斤，K2HPO4 45-80公斤，MgSO4 · 7H20 5-15公斤，生物素5-20克，和维生素Bl 5-15克。在本专利技术的具体实施方式中，第一发酵罐和第二发酵罐中的培养基配方为每18立方米培养基中含，葡萄糖650公斤，甘蔗糖蜜150公斤，玉米浆500公斤，K2HPO4 60公斤，MgSO4 · 7H20 9公斤，生物素12克，和维生素Bl 9克。优选在本专利技术第一方面的方法中，第三发酵罐的培养基配方为第三发酵罐的培养基配方为每300立方米培养基中含，葡萄糖13000-18000公斤，甘蔗糖蜜500-3000公斤，玉米浆 50-150 公斤，K2HPO4 120-180 公斤，MgSO4 ·7Η20 10-15 公斤，MnSO4 ·7H2O 100-200 公斤，生物素150-230克，和维生素Bl 15-60克。在本专利技术的具体实施方式中，第三发酵罐的培养基配方为每300立方米培养基中含，葡萄糖15000公斤，甘蔗糖蜜2000公斤，玉米浆 70 公斤，K2HPO4 140 公斤，MgSO4 · 7Η20 12 公斤，MnSO4 · 7Η20 120 公斤，生物素 200 克， 和维生素Bl 40克。步骤⑷和(5)的部分培养条件(如，温度，PH等)与步骤(3)的可以相同也可以不同。优选步骤(3)、(4)和(5)中的温度是变化的，优选是逐步向升高的，即从步骤(3)的 31-34°C，升高至步骤(4)的35-36°C，再升高至步骤(5)的38_39°C。这比恒温发酵要显著提高谷氨酸产量。另外，步骤(3)中，不进行流加操作，不干预PH ；而在步骤(4)和(5)中， PH则维持在6. 3至7. 8之间，这可以简单地通过流加碱或酸来实现。在本文中，流加量具有本领域技术人员所能常规理解的含义，具体在以重量百分比表示的时候，指的是加入物质的重量占被加入物质(如，培养液)的重量的百分比量。步骤(4)和(5)中的糖可以是葡萄糖、果糖或者蔗糖。本专利技术人发现，蔗糖被微生物同化的效果弱于葡萄糖，从而影响发酵效果。因此，优选在本专利技术第一方面的方法中，步骤(4)和 (5)中的糖是葡萄糖。在步骤中，葡萄糖的每小时流加量为第三发酵罐内培养液量的 0. 2-0. 35% (重量)，优选为0.27-0. 33% (重量)。在步骤( 中，葡萄糖的每小时流加量为第三发酵罐内培养液量的0.35-0. 6% (重量)，优选为0.38-0. 48% (重量)。优选在本专利技术第一方面的方法中，步骤(4)和( 中的氮源是无机氮源，优选是硫酸铵或氯化铵，如硫酸铵。在步骤(4)中，硫酸铵的每小时流加量为第三发酵罐内培养液量的0.1-0. 25% (重量)，优选为0. 17-0.23% (重量)。在步骤(5)中，硫酸铵的每小时流加量为第三发酵罐内培养液量的0.05-0. 12% (重量)，优选为0.07-0. (重量)。在本专利技术中，野生型RNA聚合酶sigma-32因子是本领域技术人员所知晓的，其序列如 NCBI (http//www. ncbi. nlm. nih. gov)蛋白和基因登录号 AAB18436. 1 所示。优选本专利技术第一方面的发酵方法中，所述多核苷酸编码RNA聚合酶sigma-32因子变体。在本专利技术的具体实施方式中，所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQ IDNo :2所示。其中，所述RNA聚合酶sigma-32因本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．发酵Ｌ－谷氨酸的方法，其包括：（１）将表达ＲＮＡ聚合酶ｓｉｇｍａ－３２因子变体的工程菌接入第一发酵罐于３４－３６℃培养６－１０小时；（２）将步骤（１）获得的培养液以３－７％（体积）的接种量接种于第二发酵罐，于３４－３６℃培养８－１２小时；（３）将步骤（２）获得的培养液以１０－２０％（体积）的接种量接种于第三发酵罐，于３１－３４℃培养２－４小时；（４）向第三发酵罐持续流加糖和氮源，其中糖的每小时流加量为第三发酵罐内培养液量的０．２－０．３５％（重量），而且氮源的每小时流加量为第三发酵罐内培养液量的０．１－０．２５％（重量），于３５－３６℃培养１１－１７小时；和（５）向第三发酵罐持续流加糖和氮源，其中糖的每小时流加量为第三发酵罐内培养液量的０．３５－０．６％（重量），而且氮源的每小时流加量为第三发酵罐内培养液量的０．０５－０．１２％（重量），于３８－３９℃培养１０－１８小时。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：马吉银，陈崇安，孟刚，曹洪，程耀东，刘鑫，
申请(专利权)人：宁夏伊品生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：64
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