本发明专利技术公开了一种油菜雄性不育恢复基因分子标记的制备方法及应用，步骤是：A、根据PPR基因保守氨基酸位点设计兼并引物；B、用CTAB法抽取油菜细胞质雄性不育恢复系的叶片DNA，采用降落PCR扩增出特异的恢复基因候选片断；C、PCR产物回收、转化、测序及序列分析；D、进行5’RACE与3’RACE，将测序结果拼接，获得全长cDNA序列；E、根据拼接好的全长cDNA序列在其5’UTR与3’UTR区设计特异引物，获得分子标记。同时公开了一种恢复基因的分子标记在油菜杂交种亲本选育中的应用方法，提高了恢复系选育的速度与鉴定效率，方法易行，操作性强，鉴定恢复材料速度快，极大减轻了恢复性鉴定必需经过测交及后代种植观察的工作量，提高了杂交种选育的效率。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于油菜育种和分子生物学领域，更具体地涉及一种油菜异源细胞质雄性不育恢复基因的分子标记的制备方法，同时还涉及一种油菜异源细胞质雄性不育恢复基因的分子标记在油菜杂交种亲本选育中的应用。
技术介绍
目前，杂交油菜的推广面积已占油菜生产总面积的60%以上。细胞质雄性不育是生产油菜杂交种的主要授粉控制系统。我国生产上使用的杂油菜有70%左右为细胞质雄性不育杂种，基本上是华中农业大学1972年从引进品种“波里马”中发现的波里马细胞质雄性不育(Pol CMS)配制的。Pol CMS的育性易受温度影响，低温下产生微量花粉，不育株可以自我繁殖，导致配制杂交种时一定比例的不育株存在，使杂种纯度下降，其中的不育株结实率低，影响杂交种产量潜力的发挥，增加杂交油菜利用的风险性。我国目前研究和应用的其他雄性不育细胞质有陕2A CMS、MI CMS、Nca CMS等，这些不育细胞质均是在芸薹属栽培种中经自然变异或种间杂交鉴定出来的，属于同源雄性不育胞质，均有育性不够稳定的缺点，应用时存在杂种纯度难以保证的问题，且其完全保持系和完全恢复系都不容易筛选， 大多数油菜品种都是不恢不保的类型(李殿荣.甘蓝型油菜三系选育初报.陕西农业科学，1980，(1) :26-29;傅寿仲，戚存扣，唐继红.甘蓝型油菜细胞质雄性不育系MI CMS的选育·作物学报，1989，17 (2) 151-156.刘贵华，蔡明，盛晓燕.甘蓝型油菜NCa雄性不育材料的选育及其在甘蓝型油菜中的恢保关系.中国农业科学，1997，30 (3) :61-65)。国外通过转移萝卜不育细胞质得到的育性较为稳定的萝卜质雄性不育材料(Barmerot H,Boulidard L，Cauderon Y andTempe J. Transfer of cytoplasmic male sterility from Raphanus sativus to Brassicaoleracea. Proc. Eucarpia Meeting Cruciferae :1974,52-54)， {i. 在利用过程中出现恢复系难找、恢复基因与不良品质性状连锁的问题，使得该不育系的 禾中禾Ufflii禾呈■个曼(Delourme R. ， Foisset N. ， Horvais R. ， Barret P. ， Champagne G.， Cheung W. Y. , Landry B. S. , Renard Μ.Characterisation of the radish introgression carrying the Rforestorer gene for the Ogu-INRA cytoplasmic male sterility in rapeseed (Brassicanapus L.). 1998, Theor Appl Genet 97:129-134)。从 1974 年不育系创建成功，到1999年打破恢复基因与不良品质性状的连锁，直至2000年以后才不断育成双低杂交油菜品种，实际应用进程花了将近30年的时间(Primard-Brisset C, Poupard JP, Horvais R, Eber F, Pelletier G, Renard M, Delourme R, A new recombined double lowrestorer line for the Ogu-INRA cms in rapeseed(Brassica napus L.). Theor ApplGenet. 2005 ；111 (4) :736_46)。生产上大面积应用单一细胞质生产杂交油菜存在流行性病害发生的危险，利用新的细胞质雄性不育系统对保障杂交油菜的可持续性发展具有重要意义。中国通过甘蓝型油菜与新疆野芥的体细胞杂交，创建了油菜异源细胞质雄性不育系统-野芥细胞质雄性不育系统(Nsa CMS)，与同源细胞质雄性不育系统相比，其4不育性更为稳定(胡琼，李云昌，梅德圣，方小平，Lise N. Hansen, SvenB. Andersen属间体细胞杂交创建甘蓝型油菜细胞质雄性不育及其鉴定。中国农业科学，2004，37 (3) 333-338)。通过广泛与同一体细胞杂交组合的杂交后代株系测交，获得了该不育系统的恢复系，实现了三系配套(胡琼、李云昌、梅德圣、李英德、徐育松，利用野芥不育细胞质制备油菜及十字花科蔬菜杂种的方法，ZL200710052080. 5，2010年授权)。进一步研究表明， 该不育系统的恢复系是一个二体附加系，除了含有甘蓝型油菜的38条染色体之外，还含有野芥的2条染色体，且恢复基因位于附加染色体上(Wenhui Wei，Yunchang Li, Lijun Wang, Shengyi Liu, Xiaohong Yan, Desheng Mei, Yinde Li, Yusong Xu, Pengfei Peng, Qiong Hu. Development of a novel Sinapis arvensis disomic addition line in Brassicanapus containing the restorer gene for Nsa CMS and improved resistance toSclerotinia sclerotiorum and pod shattering. TAG,2009, Theor Appl Genet TAG, 2010，120(6) :1089-97)。这使得本来就是非常麻烦的恢复系的选育更加麻烦，因为选育雄性不育系的恢复系时，一个筛选出的单株或者株系是否具有恢复性能，往往需要与不育系进行测交，直到测交下一代的开花期才能进行鉴定。而当恢复系是附加系，恢复基因又位于附加染色体上时，通过杂交很容易使附加染色体丢失，因此恢复基因也易丢失，选择和培育出新的恢复系难度加大。利用恢复基因的分子标记进行辅助筛选，将显著提高恢复系的选育效率。目前国内外尚没有开发鉴定出Nsa CMS恢复基因分子标记的报道。在此背景下， 我们根据恢复基因编码的蛋白大多具有三角状五肽重复区(Pentatricop印tide repeat, PPR)的序列特征，开发出一种Nsa CMS恢复基因的分子标记，可用于恢复系的分子标记辅助选育。
技术实现思路
本专利技术的目的是在于提供了一种油菜异源细胞质雄性不育恢复基因的分子标记的制备方法，方法易行，操作性强，其特点是特异性强，扩增重复性好，可以确定植株或品系中是否有恢复基因的存在，从而在早期鉴定油菜植株或品系对Nsa CMS的恢复性能。本专利技术的另一个目的是在于提供了一种油菜异源细胞质雄性不育恢复基因的分子标记在油菜杂交种亲本选育中的应用。通过分子标记辅助选择，鉴定和筛选恢复材料速度快，极大减轻了恢复性能鉴定必需经过测交及后代种植观察的工作量，有效提高了选择的效率和准确性。从而大大提高了油菜异源细胞质雄性不育系恢复系选育的速度与鉴定效率，加快了杂交种选育的进程。根据本专利技术提供的方法并使用本专利技术提供的实验步骤可实现上述目的。一种油菜异源细胞质雄性不育恢复基因的分子标记的制备方法，其步骤是A、本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种油菜雄性不育恢复基因分子标记的制备方法，其步骤是：Ａ、选取拟南芥１号染色体臂ＰＰＲ基因ＡＴ１Ｇ１２６２０９， ＡＴ１Ｇ６３０７０， 萝卜细胞质雄性不育的恢复基因Ｒｆ０，从美国国家生物技术信息中心数据库中提取各基因的蛋白质序列，进行多序列比对，在保守氨基酸位点处兼顾简并度最小原则设计间并引物，正向引物序列为ＴＴＹ ＧＴＮ ＡＡＧ ＧＡＲ ＧＧＮ ＡＡＧ ＣＴ，反向引物序列为ＤＡＴ ＲＡＧ ＮＧＴ ＲＴＴ ＲＴＡ ＮＧＴ ＡＡＣ；Ｂ、用ＣＴＡＢ法抽取油菜异源细胞质雄性不育恢复系的叶片ＤＮＡ，采用降落ＰＣＲ程序进行扩增，ＰＣＲ扩增体系为：ＴａｑＭＩＸ １０μｌ，ＤＮＡ模板１μｌ，正反向引物各２．５μｌ，ｄｄＨ２Ｏ ４μｌ，降落 ＰＣＲ程序为：９５℃ ２ ｍｉｎ，１４个循环，然后９５℃ ３０ ｓ， ４０℃ ４５ｓ，７２℃ ２ ｍｉｎ，２５个循环，ＰＣＲ扩增产物用２％ ｇ／ｖ琼脂糖凝胶电泳分离，ＥＢ染色后检测；Ｃ、ＰＣＲ产物回收、转化及测序：使用Ｅ．Ｚ．Ｎ．Ａ ＧＥＬ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ试剂盒回收目标片断，用ＰＧＥＭ－Ｔ ｖｅｃｔｅｒ试剂盒连接后于１６℃过夜，转化大肠杆菌ＤＨ５感受态细胞，通过篮白斑筛选获得阳性克隆，挑选３－５个阳性克隆繁殖后，菌液送样测序；Ｄ、特异片段ＤＮＡ序列分析：将从恢复系ＤＮＡ中扩增得到的特异片段测序，获得长度为３０９ ｂｐ的序列，将特异片段的ＤＮＡ序列送至ＮＣＢＩ基因序列库进行ＢＬＡＳＴ检索，获得了三个高度同源的基因序列，其中一个是从具有油菜波里马ＣＭＳ育性恢复性状的一个白菜型油菜材料中得到的克隆，在该区段上的一致性达８５％，是一个１９５３ｂｐ的表达基因序列，编码含有１６个ＰＰＲ基序的蛋白，与拟南芥１号染色体臂上的ＰＰＲ基因ＡＴ１Ｇ１２３００的同源性在７０％以上；Ｅ、特异片段可能编码的氨基酸序列及蛋白基序分析：使用ＥＢＩ ｔｒａｎｓｅｑ将此长度为３０９ ｂｐ的片段翻译成蛋白质序列，结果表明该片段编码１０３个氨基酸残基，将这１０３个氨基酸序列提交至Ｓｍａｒｔ进行结构域预测，发现其含有两个ＰＰＲ蛋白基序，各基序为３５个氨基酸，属于ＰＰＲ基因家族的ｐ亚族，其中第一个ＰＰＲ基序位于２７－６１个氨基酸区域，接着第二个位于６２－９６个氨基酸区域，两个ＰＰＲ基序的预测值分别为４．００ｅ－１０和６．６０ｅ－１２，将这１０３个氨基酸序列提交ＮＣＢＩ进行ＢＬＡＳＴ同源性搜索，获得的同源序列除了拟南芥的ＰＰＲ基因之外，全部是与植物ＣＭＳ恢复基因相关的序列，包括萝卜及甘蓝型油菜萝卜质ＣＭＳ、甘蓝型油菜波里马ＣＭＳ、水稻ＣＭＳ和矮牵牛ＣＭＳ的恢复基因；Ｆ、含特异片段的全长ｃＤＮＡ的获得：根据所得的ＤＮＡ片段设计引物，使用ＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ＣＤＮＡ ＡＭＰＩＣＡＴＩＯＮ ＫＩＴ，分别进行５’ＲＡＣＥ与３’ＲＡＣＥ，设计的ＲＡＣＥ引物序列如下：３’ＲＡＣＥ ＧＳＰ：５’ＧＧＣＴＡＡＧＣＡＧＡＴＧＡＴＧＧＡＣＣＴＧＡＴＧＧＣＴＡＧＣＡＡＧＧＧ３’，５’ＲＡＣＥ ＧＳＰ： ５’ＡＴＧＴＣＣＡＣＧＡＧＡＧＧＧＧＴＧＧＴＴＧＣＣＡＡＴＡＣＡ３’；将扩增得到的ＲＡＣＥ片段分别回收测序，测序结果经ＳＥＱＭＡＮ软件拼接，获得全长ｃＤＮＡ序列；Ｇ、根据拼接好的全长ｃＤＮＡ序列在其５’ＵＴＲ与３’ＵＴＲ区设计引物，使用该基因特异引物分别对育性分离群体中可育株与不育株进行ＲＴ＿ＰＣＲ扩增，并对异源细胞质雄性不育系统的恢复系、保持系、不育系以及同源细胞质雄性不育系统的恢复系基因组ＤＮＡ进行扩增，ＰＣＲ扩增体系及程序为：ＴａｑＭＩＸ １０μＬ，ＤＮＡ模板１μＬ，正反向引物各１．５μＬ ，ｄｄＨ２Ｏ ６μＬ，ＰＣＲ扩增程序为９５℃ ５ｍｉｎ，９４℃ ３０ ｓ，６４℃ ４５ｓ，７２℃ ３ ｍｉｎ，共３４个循环，然后７５℃ １０ｍｉｎ，ＰＣＲ扩增产物用１．５％ｇ／ｖ琼脂糖凝胶电泳分离，ＥＢ染色后检测，在异源细胞质雄性不育恢复系中有分子量约２．１ｋｂ的扩增产物，在不育系、保持系及同源细胞质雄性不育恢复系中都无扩增产物，因此，根据全长ｃＤＮＡ序列５’ＵＴＲ与３’ＵＴＲ区设计的特异引物，其正向引物的序列为：ＴＡＣＧＣＧＧＧＧＡＧＡＧＡＡＧＣＴＴＧＴＣＴＣＧ，反向引物的序列为： ＣＡＣＡＴＣＡＴＡＡＣＡＣＡＣＴＡＡＣＣＡＧＧＡＣＴＴＴＧＴＣＴＣ，扩增出的长度约为２．１ｋｂ 的ＤＮＡ片段作为油菜野芥细胞质雄性不育恢复基因的分子标记，获得了一种油菜异源细胞质雄性不育恢复基因的分子标记。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：胡琼，李云昌，郝建轶，梅德圣，付丽，李英德，徐育松，
申请(专利权)人：中国农业科学院油料作物研究所，
类型：发明
国别省市：83
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