一种结核分枝杆菌利福平耐药突变的检测方法及试剂盒。涉及结核分枝杆菌耐药突变的检测技术提供一种快速、灵敏、特异的结核分枝杆菌利福平耐药突变的检测方法及试剂盒，包括提取结核分枝杆菌样本的DNA；根据结核分枝杆菌利福平耐药决定区(RRDR)所在rpoB基因序列(GenBank：L27989)，利用引物设计软件Primer?Premier?5设计引物和探针；构建双管双色实时PCR体系，对结核分枝杆菌利福平耐药决定区的突变进行检测，比较所检测样品与阳性对照之间熔解曲线的熔点(Tm值)的差异，判断样品是否发生突变。引物是设计在rpoB基因利福平耐药决定区的两端，具有高度的特异性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及结核分枝杆菌耐药突变的检测技术，特别涉及一种基于双标记自淬灭探针的探针熔解曲线分析技术用于检测结核分枝杆菌利福平耐药突变。
技术介绍
20世纪80年代以来，结核病疫情重新上升，成为与艾滋病并列的全球性危害最严重的传染病。据世界卫生组织统计，目前全球三分之一的人口感染结核分枝杆菌，每年新增 800万病人，死亡200 300万人，是目前死亡率最高的传染性疾病。根据世界卫生组织的评估，我国是世界上22个结核病高负担国家之一，患者人数仅次于印度，居全球第二位。今年召开的第二届全球遏制结核病伙伴论坛大会上，将我国列在需要特别引起警示的国家和地区的第一位。利福平(rifampin，RFP)为利福霉素类半合成广谱抗菌药，该药对结核分枝杆菌和部分非结核分枝杆菌(包括麻风分枝杆菌等)在宿主细胞内外均有明显的杀菌作用。该药物自1971年专利技术以来，一直是结核化疗方案中的关键药物，而且，利福平耐药是耐多药结核的标志，因此，对结核分枝杆菌利福平耐药性的检测非常必要。由于需要及时为结核病患者制定出合理的治疗方案，必须找到一种快速准确地检测结核分枝杆菌耐药情况的方法。现有的检测方法可分为表型检测和基因检测两大类。表型检测中的药物敏感性试验(Drug susceptibility testing, DST)以及噬菌体生物扩增法已应用于临床，但这些方法各有其局限性。由于结核分枝杆菌生长缓慢，常规药敏检测方法至少需要6 8周才能得到结果。BACTEC TB-460液体培养基药敏检测方法虽然速度较快，但需昂贵的设备及培养基，且易受杂菌污染。噬菌体生物扩增法(l、Eltringham，I. J.， Wilson,S. Μ. and Drobniewski,F. A. Evaluation of a bacteriophage-based assay(phage amplified biologically assay)as a rapid screen for resistance to isoniazid, ethambutol, streptomycin,pyrazinamide,and ciprofloxacin among clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol ，1999，37，3528-3532.)操作复杂， 受干扰因素多，因此，目前的表型检测难以快速高效地给出耐药结果。由于结核分枝杆菌利福平耐药主要与rpoB基因突变有关(2、Zaczek，A.， Brzostek,A. ,Augustynowicz-Kopec, Ε. ,Zwolska,Z. and Dziadek,J.Genetic evaluation of relationship between mutations in rpoB and resistance of Mycobacterium tuberculosis to rifampin. BMC Microbiol. 2009，9，10.)，因此基因检测法更为直接， 近年来也得到了较快发展。基因检测法通过对耐药相关基因的扩增及序列分析，可以较快的给出耐药信息，甚至可以在几h内给出结果。目前已有的分析方法有线性探针杂交法(3、Abe，C.，Ogata，H.，Kawata, K.，Hiraga, T.，Takashima, T. and Suetake, Τ. (2000) .Kekkaku，75，575-581·)，单链多态性分析法(SSCP) (4、He，X·，Zhuang, Y.and Li， G. (1996). Zhonghua Jie He He Hu Xi Za Zhi，19，338—341.)，DNA 直接测序法(5、Kim, B. J.，Lee, K. H.，Park, B. N. ， Kim, S. J. ， Park, Ε. M. ， Park, Y. G. ， Bai, G. H. and Kook, Y. H. (2001) Detection of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis in sputa by nested PCR-Iinked single-strand conformation polymorphism and DNA sequencing, j Clin Microbiol, 39，26104617.)，限制性片段长度多态性分析，高分辨熔解曲线法(6、Pietzka，Α. Τ.， Indra，Α.，Stoger, Α.，Zeinzinger, J.，Konrad，Μ.，Hasenberger, P.，Allerberger, F. and Ruppitsch， W. (2009)Rapid identification of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates by rpoB gene scanning using high-resolution melting curve PCR analysis. J Antimicrob Chemother.)以及芯片检测(7、Yue，J. , Shi, W.，Xie， J.，Li，Y.，Zeng，Ε.，Liang，Land Wang，H. (2004) Detection of r if ampin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains by using a specialized oligonucleotide microarray. Diagn Microbiol Infect Dis，48，47-54.)等。上述方法在检出率以及通量上各有不同，但是共同的缺点是有PCR后处理过程，这就使得检测步骤繁琐，且增加了引起PCR产物污染的几率。目前较有应用前景的试剂盒有比利时^mogenetics公司的 INNO-LiPA Rif. TB i式齐[J ^ (8、Pourahmad, F. ， Thompson, K. D. ， Taggart, J. B. ， Adams, A. and Richards, R. H. (2008) Evaluation of the INNO-LiPA mycobacteria v2 assay for identification of aquatic mycobacteria. J Fish Dis，31，931-940.)以及德国 Hain 公司的 Geno Type MTBDRpIus assay 试剂盒(9、Lacoma, Α.，Garcia-Sierra，N.，Prat, C.， Ruiz-Manzano, J.，Haba, L，Roses，S.，Maldonado，J. and Dominguez, J. (2008) Geno Type MTBDRpIus assay for molecular detection of rifampin and isoniazid resist本文档来自技高网...
【技术保护点】
熔点低于阳性对照至少２℃时判定为突变型，试验菌株对利福平耐药。色实时ＰＣＲ体系，对结核分枝杆菌利福平耐药决定区的突变进行检测，比较所检测样品与阳性对照之间熔解曲线的熔点的差异，判断样品是否发生突变；４个通道中样品的熔点与阳性对照的熔点均一致时判定为野生型，试验菌株对利福平敏感；４个通道任一通道中样品的１．一种结核分枝杆菌利福平耐药突变的检测方法，其特征在于包括以下步骤：１）提取结核分枝杆菌样本的ＤＮＡ；２）根据结核分枝杆菌利福平耐药决定区所在ｒｐｏＢ基因序列，利用引物设计软件Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ ５设计引物和探针；３）构建双管双
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李庆阁，胡思玉，张轶，刘歆，
申请(专利权)人：厦门大学，厦门致善生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：92
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