一种结核分枝杆菌异烟肼耐药突变检测方法及试剂盒。涉及结核分枝杆菌耐药突变的检测技术，提供一种低成本、高通量、简便和特异的结核分枝杆菌异烟肼耐药突变检测方法，设计引物和探针：根据GenBank中结核分枝杆菌H37Rv基因组核酸序列，利用引物设计软件Primer?Premier?5设计引物和探针；提取结核分枝杆菌样本的DNA；建立PCR反应体系；PCR反应结束后，产物通过熔解曲线进行分析，根据熔解峰的熔点和形状的差异，区分野生型和突变型。采用实时PCR熔解曲线法，不仅能够覆盖几乎所有已知的耐药突变类型，而且具有成本低、操作简便、反应快速、通量高等优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及结核分枝杆菌耐药突变的检测技术，尤其涉及一种结核分枝杆菌异烟胼耐药突变检测方法及试剂盒，该方法是一种基于双标记自淬灭探针的探针熔解曲线分析技术用于检测结核分枝杆菌异烟胼耐药突变。
技术介绍
20世纪80年代以来，由于艾滋病和多重耐药结核菌的出现以及流动人口的增加， 结核病发病率重新上升，逐渐成为全球危害最严重的传染病。根据世界卫生组织2009年的报告，目前全球有三分之一的人口即20亿人感染结核分枝杆菌，每年新增病人超过900万， 其中42万为多药耐药结核，死亡200万。我国是世界上22个结核病高负担国家之一，患病人数仅次于印度居全球第二位，而且耐药情况严重，耐药率高达27. 8%，给结核病的预防和治疗构成严峻挑战。药敏实验周期过长(需6 8周时间)成为多药耐药结核(MDR-TB)传播的一个主要原因，因此快速诊断对于合理有效地指导临床用药和控制MDR-TB的传播十分必要。由于结核菌耐药的产生主要是基因组DNA中抗结核药物作用靶基因突变所致，因此基因检测更为直接，近年来也得到较快发展。基因检测法的基本过程为先扩增耐药相关基因，然后分析扩增产物。异烟胼(isoniazid，INH)是1952年开始用于临床的酰胼类化学合成药，是结核病治疗的一线核心药物，同时也是结核分枝杆菌隐性感染的首选药物。但是到目前为止， 异烟胼作用的靶分子、作用机制以及结核分枝杆菌耐异烟胼的机制仍不完全明确。较多文献报道它是一种前提药物，在菌体内被katG基因编码的过氧化氢酶-过氧化物酶激活， 作用于细胞壁分枝菌酸合成途径中的酶系而干扰分枝菌酸的生物合成，最终导致菌体细胞壁损伤而死亡。异烟胼耐药相关突变主要发生在KatG315位点，inhA94位点，inhA启动子区禾口 ahpC 启动子区(除-46 位点)(1. Hazbon, M. H. , et al. , Population genetics study of isoniazid resistance mutations and evolution of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother,2006. 50 (8) 2640-2649. 2. Luo,Τ. ,et al. , Selection of mutations to detect multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis strains in Shanghai, China.Antimicrob Agents Chemother. 54(3) 1075-1081. 3. Zhang,Μ. ,et al. , Detection of mutations associated with isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis isolates from China. J Clin Microbiol, 2005. 43(11) :5477-5482.)。ahpC 启动子区-46G — A 为多态性位点，在野生株和突变株均有存在，与耐药突变无关(4、Doustdar，F.，et al. ,Molecular analysis of isoniazid resistance in different genotypes of Mycobacterium tuberculosis isolates from Iran. Microb Drug Resist,2008. 14(4) :273-279.)。目前，应用较多的结核耐药突变分析技术包括Sanger测序、线性探针反向杂交法和固相芯片法等。Sanger测序是突变检测的“金标准”，但是在结核耐药检测上，仅适用于突变热点集中的利福平耐药检测，而对于异烟胼耐药位点分散的情况，需要进行多个测序反应，费时费力而且花费昂贵(5. Hazbon, Μ. H. , Recent advances in molecular methods for early diagnosis of tuberculosis and drug-resistant tuberculosis. Biomedica, 2004. 24 Supp 1 :149-162.)。2008年世界卫生组织推荐使用德国Hain公司的GenoType MTBDRpIus assay试剂盒来检测结核多药耐药(MDR-TB)。它采用线性探针杂交纸条膜技术，在一张试纸条上分别用8条野生型和4条突变型探针覆盖利福平rpoB核心区及其常见突变，用3条野生型和6条突变型探针分别覆盖异烟胼耐药katG315位点和inhA启动子区基因及其常见突变。GenoType MTBDRpIus检测临床分离株和抗酸染色阳性标本有更高的灵敏度和特异性 (6. Ling, D.I. , A. A. Zwerling, and M Pai, GenoType MTBDR assays for the diagnosis of multidrug-resistant tuberculosis :a meta-analysis. Eur Respir J,2008. 32(5) 1165-1174.)。博奥结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒采用DNA微阵列芯片法，能够筛查利福平耐药rpoB核心区13种突变，以及异烟胼耐药katG315位点和inhA启动子区4种突变。上述两种试剂盒的共同特点是均采用固相杂交模式对PCR产物进行检测，需通过显色反应步骤或者荧光信号来判读结果。整个过程操作步骤多，时间长，易引起PCR产物对后续扩增的污染。尤其是，这两种试剂盒都通过终点信号判读结果，无论人工判读还是机器自动判读，都会因为标本中经常出现的不均一杂交信号而产生所谓的“灰区”，导致结果无法判读。另外，当突变基因或位点成为试剂盒不覆盖的类型时，在结果中由于仅出现野生信号，而造成误判。针对结核耐药位点分散、突变类型复杂等特点，近年来还出现了高通量筛查技术应用于结核耐药突变分析的报道，如液相芯片(QIAplex多重扩增联合Luminex xMAP平台检测(7. Gegia, M. , et al. , Prevalence of and Molecular Basis for Tuberculosis Drug Resistance in the Republic of Georgia Validation of a QIAplex System for Detection of Drug Resistance-Related Mutations. Antimicrob Agents Chemother, 2008. 52(2) 725-729. ]) > MLPA (8. Bergval, I. L. , et al. , Development of multiplex assay for rapid characterization of Mycobacterium tuberculosis.J Cl in Microb本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种结核分枝杆菌异烟肼耐药突变检测方法，其特征在于包括以下步骤：１）设计引物和探针：根据ＧｅｎＢａｎｋ中结核分枝杆菌Ｈ３７Ｒｖ基因组核酸序列，利用引物设计软件Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ ５设计引物和探针；２）提取结核分枝杆菌样本的ＤＮＡ；３）建立ＰＣＲ反应体系；４）结果判定：ＰＣＲ反应结束后，产物通过熔解曲线进行分析，根据熔解峰的熔点和形状的差异，区分野生型和突变型，即完成对结核分枝杆菌异烟肼耐药突变的检测。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李庆阁，胡思玉，权胜卯，
申请(专利权)人：厦门大学，厦门致善生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：92
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