本发明专利技术提供了一种优化的高活性人溶菌酶基因及其表达载体，根据毕赤酵母密码子的偏好性对基因序列进行优化并人工合成人溶菌酶基因，构建重组质粒pUC18-T-HZ和pPICZαΑ-HZ，将重组质粒pPICZαΑ-HZ线性化后转到毕赤酵母中，筛选获得阳性转化子，经实验结果表明重组毕赤酵母分泌表达了高活性的人溶菌酶，表达产物具有明显抑菌活性。本发明专利技术采用毕赤酵母表达系统可以获得高表达量、高活性的人溶菌酶，克服了以其他方式获取溶菌酶的成本高、表达量低和活性低的缺点。通过高活性、低成本溶菌酶的生产与推广应用，不仅对我国饲料畜牧业的发展产生可观的经济效益和社会效益，同时也可产生巨大的生态效益。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学制药
，具体涉及一种优化的人溶菌酶基因及其表达载体和应用。
技术介绍
溶菌酶(Lysozyme)全称为1，4_ β -N-溶菌酶，又称粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶。它由英国细菌学家Fleming在1922年首先在人的唾沫、眼泪和鼻涕中发现，因其能溶解细菌细胞壁而具有溶菌作用而得其名。溶菌酶是人和动物体液和组织中的一种重要的防御因子，具有杀菌效果强，杀菌谱广，稳定性强，易被机体所接受的特点，还能促进免疫功能恢复，并且没有任何毒副作用和不良反应。因此溶菌酶作为一种生物制剂，被广泛应用于食品、饲料工业和临床医学。 人溶菌酶参与机体的防御机制，有抗感染、抗肿瘤和免疫调节的作用，具有潜在的临床应用价值，在饲料、食品工业上也具有广泛的用途。目前，国外已有小规模将人溶菌酶用于临床的报道，治疗效果也较好，且不会产生耐药性。人溶菌酶是溶菌酶中的一种，通常人溶菌酶是从人奶或胎盘中少量提取获得。由于其来源困难，不能进行工业化生产，采取DNA重组技术，从原核或真核表达系统生产人溶菌酶是解决其供需矛盾的有效途径。酿酒酵母表达系统已被广泛应用，虽已积累大量经验，但也存在诸多不足之处，如菌株生长速度慢、密度不高、外源蛋白的表达和翻译后加工都不够理想。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术中利用酿酒酵母表达系统生产人溶菌酶所存在的菌株生长速度慢、密度不高且外源蛋白的表达和翻译后加工不理想的不足，提供了一种优化的高活性人溶菌酶基因及其表达载体，本专利技术利用巴斯德毕赤酵母表达系统来作为生产人溶菌酶的表达系统，它具有生产成本低、操作简单、生长迅速、表达效率高、转录后加工修饰和良好的发酵与分泌性能等优点，本专利技术优化后的人溶菌酶基因经毕赤酵母表达系统产生的人溶菌酶具有高活性、高表达量的优点。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用下述技术方案予以实现本专利技术提供了一种优化的高活性人溶菌酶基因HZ，它具有序列表SEQ ID N0:1的碱基序列，克隆所述基因的特异性引物为引物 Fl :5’ -ACGAATTCAAGGTTTTTGAAAGATGTGA-3’ 引物 Rl :5’ -ACGCGGCCGCTTATGGAGCAACGAAGAAAA-3’ 引物 AOXl :5’ -GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’ 3’ - GCAAATGGCATTCTGACATCC -5，本专利技术还提供了一种高活性人溶菌酶，其具有序列表SEQ ID NO: 1编码的SEQ ID NO:2 的氨基酸序列。本专利技术还提供了含有所述人溶菌酶基因HZ的重组载体，所述重组载体为 PUC18-T-HZ 禾口 pPICZ α A -HZ。本专利技术还提供了所述人溶菌酶在作为饲料添加剂、食品添加剂和制药中的应用， 所述人溶菌酶可制备用于抗菌、抗病毒、抗肿瘤的药物，所述人溶菌酶与甘氨酸、植酸、聚合磷酸盐物质配合使用。本专利技术选择活性较强的人溶菌酶基因，根据毕赤酵母密码子的偏好性对基因序列进行优化，并人工合成优化后的人溶菌酶基因，将其与PUC18-T载体连接后转入大肠杆菌中获得重组质粒PUC18-T-HZ，以重组质粒pUClS-T-HZ为模板，用F1、R1引物进行PCR扩增得到目的基因片段HZ。将合成的优化后的人溶菌酶基因与真核载体pPICZ α A连接，构建了重组质粒PPICZ α A -HZ。将重组质粒pPICZ α A -HZ线性化后经电击转化法转到毕赤酵母GS115中，筛选能在MD和匪上生长良好的Mut+的菌落，然后经抗生素kocin筛选获得阳性转化子，将阳性转化子接种于BMGY液体培养基中，于观250 r/min摇床培养至 0D_为2.0 — 6.0左右，离心收集菌体，后转接到装有新鲜BMMY液体培养基中进行诱导表达。同时进行最佳诱导表达条件的探索，以确定表达的最佳条件。诱导结束后，培养液室温离心收集上清，将诱导上清进行SDS-PAGE，得到与预期一致大小约为15. 26kD的目的条带， Western blot中将SDS-PAGE中的蛋白转移至硝酸纤维素膜上，用兔抗人溶菌酶的单抗作为一抗，用羊抗兔IgG的酶标抗体作为二抗，最后用二氨基联苯胺(DAB)显色。结果表明，目的条带与兔抗人溶菌酶的单抗发生特异反应，确证重组毕赤酵母分泌表达了人溶菌酶HZ。 用溶壁微球菌平板溶圈法鉴定表达产物的活性，检测得知具有明显抑菌活性。与现有技术相比，本专利技术的优点和积极效果是本专利技术采用毕赤酵母表达系统可以获得高表达量、高活性的人溶菌酶，不受原材料来源的限制，克服了以其他方式获取溶菌酶的成本高、表达量低和活性低的缺点。通过高活性、低成本溶菌酶的生产与推广应用，不仅对我国饲料畜牧业的发展产生可观的经济效益和社会效益，同时也可产生巨大的生态效益。结合附图阅读本专利技术的具体实施方式后，本专利技术的其他特点和优点将变得更加清林疋。附图说明图1是Genbank中现有人溶菌酶基因序列与本专利技术优化后人溶菌酶基因序列对比图谱。图2是本专利技术中以重组质粒PUC18-T-HZ为模板，用F1、R1引物进行PCR扩增产物的电泳图谱，图中1表示DL2000 DNA marker ； 2表示PCR扩增产物。图3是本专利技术中重组表达质粒pPICZ α A-HZ的构建图谱。图4是本专利技术中重组表达质粒pPICZ α A-HZ的PCR鉴定电泳图谱，1表示DL2000 DNA marker ；2 表示质粒 pPICZ α A-HZ 的 PCR 产物。图5是本专利技术中重组表达质粒pPICZ α A-HZ的酶切鉴定电泳图谱，图中1表示 DL2000 DNA marker ；2和3表示表达载体pPICZ α A-HZ经EcoR I +Not I酶切后产物。图6是本专利技术中重组菌株的通用引物AOXl的PCR验证图谱，1，2，3，4，5表示 GS115/ pPICZ α A-HZ 的 PCR 产物；6 表示 DL2000 DNA marker 图7是本专利技术中人溶菌酶蛋白SDS-PAGE的凝胶图谱，图中1表示蛋白MW Marker ； 2表示重组菌株GS115/ pPICZaA-HZ表达上清；3表示重组菌株GS115/ pPICZ a A诱导上清。图8是本专利技术中牛血清白蛋白标准曲线。图9是本专利技术中人溶菌酶蛋白的Western blot分析图谱。具体实施例方式下面结合附图和具体实施方式对本专利技术的技术方案作进一步详细的说明。实施例1一、溶菌酶基因的选择、优化和合成 1、溶菌酶基因的选择来源不同的溶菌酶活性存在差异，人溶菌酶活性比鸡蛋清溶菌酶高3倍；而从牛、马、 羊等动物的乳汁中分离出的溶菌酶，其溶菌活性也远低于人溶菌酶；植物溶菌酶对溶壁小球菌的溶菌活性不超过鸡蛋清溶菌酶的1 / 3。因此本专利技术选择活性较强的人溶菌酶基因进行表达。2、溶菌酶基因序列的优化外源基因的内在特性如密码子偏好性是影响外源蛋白有效表达的重要因素。本专利技术根据毕赤酵母密码子偏好性，将溶菌酶基因的酵母低频密码子优化成高频密码子，以提高目的蛋白的翻译速度和表达量。人溶菌酶基因的核苷酸序列与Genbank中人溶菌酶基因序列对比如附图1所示。在附图1中，图谱上面一条序列是Genbank中人溶菌酶基因序列(NCBI序列号 NM_000239.幻，下面一条是优化后的人溶菌酶基因序列，两者对比本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种优化的高活性人溶菌酶基因ＨＺ，其具有序列表ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１的碱基序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：孙同毅，张大伟，王希辉，
申请(专利权)人：青岛根源生物技术集团有限公司，
类型：发明
国别省市：95
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