一种病原丝状真菌特异性启动子及其应用制造技术

一种病原丝状真菌的特异性启动子，其核苷酸序列为至少含有SEQ?ID?NO.1所示的DNA序列；或与SEQ?ID?NO.1所示序列互补的DNA序列；或与SEQ?ID?NO.1所示序列或其互补序列具有90％或90％以上相似性，且具有相同功能的DNA序列。经实验研究证明本发明专利技术启动子在附着胞时期特异性高效表达，为研究病原丝状真菌在附着胞形成及穿透寄主体壁过程的调控，以及野生型昆虫病原菌株基因工程改造提供了重要工具，具有重要很好的应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及一种丝状真菌特异性启动子及其应用。
技术介绍
病原丝状真菌，包括植物病原真菌和昆虫病原真菌，侵染宿主时，首先要形成侵染结构附着胞。附着胞的功能是提供机械压力和分泌水解酶，以形成侵染钉穿透宿主体壁；因此，附着胞的形成对于病原丝状真菌成功侵染宿主至关重要。目前，对病原真菌附着胞形成期间的基因表达已有一些报道，但对附着胞形成和分化过程中的基因调控目前尚无报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种病原丝状真菌的特异性启动子，所述启动子来自于蝗绿僵菌，其能够在病原丝状真菌附着胞形成期特异性表达。本专利技术的另一目的在于提供上述启动子在制备高侵染能力的转基因菌株中的应用，其能够驱动同、异源基因在附着胞形成期间高效表达。本专利技术病原丝状真菌的特异性启动子PMagasl，来源于蝗绿僵菌(Metarzhizium acridum)Magasl基因的上游序列，可以是下述核苷酸序列之一(1)至少含有SEQ ID NO. 1所示的DNA序列；(2)与SEQ ID NO. 1所示序列互补的DNA序列；(3)与SEQ IDN0. 1所示序列或其互补序列具有90%或90%以上相似性，且具有相同功能的DNA序列。本领域普通技术人员均知晓因不同启动子之间核苷酸相似性非常低， 通常只是其中的一些顺式作用元件具有保守性，改变启动子中某些非重要核苷酸并不会影响启动子的活性，但改变几个核苷酸会导致相似性低于100%、大于等于90%，因此与SEQ ID NO. 1所示序列或其互补序列具有90%或90%以上相似性，且具有相同功能的DNA序列也属于本专利技术的保护范围。含有上述病原丝状真菌的特异性启动子的重组表达载体、转基因菌株以及该转基因菌株的制备方法等均属于本专利技术的保护范围。本专利技术构建了含有PMagasl启动子驱动外源基因的表达载体，在一个优选的实施方式中，所述的表达载体为PMagasl-EGFP，其具有如图1所示的结构。本专利技术含上述病原丝状真菌的特异性启动子的转基因菌株的构建方法，包括以下步骤(1)、将PMagasl启动子与目的基因可操作地连接；(2)、构建含有PMagasl启动子与目的基因的表达载体；(3)、将所述表达载体转化菌株，得到转基因菌株。侵染结构附着胞的形成是植物和昆虫病原真菌侵染的前提条件，专利技术人对蝗绿僵菌基因组的研究中发现，其Magasl基因在附着胞期间大量表达，专利技术人随后经大量实验研究证明PMagasl启动子在附着胞时期特异性高效表达。本专利技术启动子为研究病原丝状真菌3在附着胞形成及穿透寄主体壁过程的调控，以及野生型昆虫病原菌株基因工程改造提供了重要工具，具有重要很好的应用价值。附图说明图1 :PMagasl_EGFP表达载体图谱；其中PMagasl =Magasl基因启动子；EGFP 绿色荧光蛋白；TTrpC 构巢曲霉色氨酸合成酶基因终止子；Bar cassette 除草剂抗性元件； Kan 卡那霉素抗性元件；LB和RB为Ti质粒双元载体左右边界。图2 转化子PCR电泳验证图；M =DNA标准；泳道1_13为13个不同转化子；NC 阴性对照，蝗绿僵菌CQMal02野生型菌株；PC 阳性对照，含bar抗性元件的质粒。图3 =PMagasl-EGFP蝗绿僵菌转化子在各阶段的荧光观察；A 转化子孢子；B 萌发的孢子；C 附着胞；D 菌丝；E 血淋巴中菌丝体；标尺为10 μ m。图4 不同生长时期Magasl半定量RT-PCR ； 1-6分别为孢子、萌发孢子、菌丝、附着胞、体内菌丝及体表孢子总RNA中Magasl表达分析；组成型基因gpd作为内参。具体实施例方式下面通过实施例对本专利技术进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本专利技术进行进一步说明，不能理解为对本专利技术保护范围的限制，在不背离本专利技术精神和实质的情况下，对本专利技术方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本专利技术的范围。以下所使用的方法如无特殊说明，均为常规方法；所用材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业得到。实施例1 启动子的分离本专利技术中所用菌株为蝗绿僵菌(Metarzhizium acridum)菌株CQMal02。取培养在1/4SDAY培养基(葡萄糖10g/L，蛋白胨2. 5g/L，酵母浸膏5. Og/L，琼脂18g/L，pH值调至6. 0)上的CQMal02菌株IO5个孢子，接种于1. 5ml 1/4SDAY液体培养基中，28°C 250rpm 振荡培养3天，用真菌基因DNA提取试剂盒(Biof lux，杭州)提取基因组DNA。用已克隆的Magasl基因序列与已有的蝗绿僵菌基因组序列进行比对，获取 Magasl基因上游的部分序列，通过启动子预测软件分析，截取1222bp的一段序列，设计引物 PMagas 1F5，CGactaRtTTGTACGGAGTACTCCAG ACGT3，(含有 SpeI 酶切位点)和 PMagasl R5’ CArrrcccGGATAAGGTAGGGGGTTTTGTA3‘(含有 ApaI 酶切位点)。以提取的基因组 DNA 为模板，进行扩增。扩增体系(25μ 1) =IOXLA Taq缓冲液2. 5μ l，25mMMgCl2 1.5μ1，引物 PMagaslF和 PMagaslR各 1 μ 1，IOmM dNTPs 0. 5 μ 1, LATaq 0. 25 μ 1，基因组DNA Ιμ ，超纯水 17. 75 μ 1。PCR 扩增程序为:94°C预变性 4min ；94°C 30s, 58°C 30s, 72°C 1. 5min 30 个循环，然后72°C延伸5min ；4°C保存。电泳结果显示PCR扩增出目标带约1200bp。得到的PCR 产物克隆到PMD18-T中间载体上，DNA测序验证，该PCR产物具有序列的核苷酸序列。将含有启动子PMagasl的pMD18_T载体用ApaI和SpeI酶切后插入PDPB载体上(Cao，Y.，Peng， G. , He, Ζ. , Wang, Ζ. , Yin, Y. , Xia, Y. , 2007. Transformation of Metarhizium anisopliae with benomyl resistance and green fluorescent protein genes provides a tag for genetically engineered strains. Biotechnol. Lett. 29,907-911)。实施例2 :PMagas I-EGFP表达载体构建根据EGFP 序列设计引物 EGFPF5，ATgggcccATGGTGAGCAAGGGCGAGG3，(下划线为 ApaI 酶切位点)禾Π EGFPR5’ CAcccgggTTACTTGTACAGCTCGTCC3，(下划线为 SmaI 酶切位点)， 从pEGFPN-Ι质粒(BD，USA)扩增EGFP序列，测序验证序列正确性。将EGFP扩增产物用ApaI 和SmaI酶切后插入同样用ApaI和SmaI切过PDPB-PMagasl上。构建PDPB-PMagasl-EGFP 载体。转化大肠杆菌后，提取质粒。用SpeI切PDPB-PMagasl-EGFP载体将表达元件本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种病原丝状真菌的特异性启动子，其特征在于：它的核苷酸序列是：（１）至少含有ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１所示的ＤＮＡ序列；或（２）与ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１所示序列互补的ＤＮＡ序列；或（３）与ＳＥＱ　ＩＤＮＯ．１所示序列或其互补序列具有９０％或９０％以上相似性、且具有相同功能的ＤＮＡ序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：曹月青，焦润，夏玉先，朱祥先，
申请(专利权)人：重庆大学，
类型：发明
国别省市：85