一种基于发根农杆菌感染的诱发黄芩毛状根的培育方法技术

本发明专利技术公开了一种基于发根农杆菌感染的诱发黄芩毛状根的培育方法，利用发根农杆菌菌液侵染黄芩外植体，诱导黄芩外植体形成毛状根，黄芩毛状根在MS固体培养基上呈黄色毛发状，能稳定合成黄芩苷，对其ITS测序，鉴定该毛状根为黄芩属黄芩毛状根。然后在选育培养基中进一步选育，优化培养条件，以选育提高毛状根中药用有效成分黄芩苷的含量的株系。通过发根农杆菌诱导黄芩属黄芩得到毛状根，诱导率可达10～40％，所得黄芩毛状根呈黄色毛发状，能稳定合成黄芩苷，本发明专利技术将黄芩属黄芩毛状根在优化培养基上培养，其生长迅速，在30～35天其生物量能增值23～35倍，并且只需在黑暗条件下培养，低能耗，低成本，适合工业化生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于黄芩的人工培育
，涉及。
技术介绍
黄芩(Scutellariabaicalensis Georgi.)为唇形科(Labiatae)植物，是一种常用的中药。其性寒、味苦，归肺、心、肝、胆、大肠经，具有抗菌消炎、清热燥湿、泻火解毒、止血安胎等功效。黄芩为多年生草本植物，喜温和气候，耐寒冷、干旱，主要分布于河北、辽宁、陕西、山东、内蒙古等地，主要成分是黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素等。随着国际上对黄芩研究的深入，黄芩的主要成分黄芩苷在清除氧自由基、减轻组织的缺血再灌注损伤、调节免疫以及抗肿瘤和HIV等多方面均有较好作用。随着新药不断开发，黄芩苷用量迅速增加， 近年来，药材产地环境污染和农药喷施，都给黄芩资源的可持续发展带来严重危机。自1997年Ackermarm首先用发根农杆菌转化高等植物以来，迄今已有100多种植物建立了培养系统。利用发根农杆菌诱导植物产生毛状根，并对毛状根进行离体培养，生产有用的次生代谢产物，是使该植物可持续发展的有效途径之一。毛状根生长迅速，分支多无向地性，激素自养，生理生化、遗传特征稳定，次生代谢产物含量高，处于器官化水平，基本上保持了正常根的生化功能，且比细胞培养容易放大，该方法特别适合根用植物。因此通过大量培养毛状根替代野生资源，对保护环境与中药的可持续发展具有重大意义。
技术实现思路
本专利技术解决的问题在于提供，能够快速、高诱发率的诱发毛状根，解决黄芩资源短缺的问题。本专利技术是通过以下技术方案来实现1)将无菌的黄芩外植体接种于预培养基上，25 黑暗条件下预培养2 3d ；所述的预培养基为含有0. 15 1. Omg/kg 6-BA禾口 0. 1 0. 35mg/kg NAA的MS固体培养基；2)在预培养的黄芩外植体上划痕，加入活化的发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的菌液，并添加乙酰丁香酮，使其终浓度为200 600 μ g/mL，感染10 30min ；吸弃剩余的菌液后，将黄芩外植体转移到MS固体培养基上，25 黑暗培养2 3d，再转移到含抗菌素的MS固体培养基上，25 黑暗培养，诱发毛状根；3)待经发根农杆菌感染的黄芩外植体上长出的毛状根达到2 3cm时，在无菌条件下切下毛状根，将其转移到含抗菌素的MS固体培养基上，25 黑暗培养，直至发根农杆菌生长被抑制，然后切取毛状根；4)将切取的毛状根接种于MS固体培养基上，25 避光培养，每30天继代培养一次；5)选取MS固体培养基继代培养2次以上、生长旺盛的毛状根，切取根尖部分，接种到MS液体培养基上，100 200r/min振荡、25 避光培养，筛选生长迅速、能稳定产生黄芩苷的黄芩毛状根株系；6)选取MS液体培养基中生长旺盛的黄芩毛状根株系，切取根尖部分，接种到优化培养基上，100 200r/min振荡、25 避光培养，培养到32 38d补加培养液，培养至 60 80天收获毛状根；所述的优化培养基是在毛状根液体基本培养基上添加10 60g/L的碳源、0. 3 1. Og/L的氮源、20 100mg/L的生物诱导子、5. 3Χ1(Γ5 3. Ommol/L的非生物诱导子和 0. 2 0. 6mg/L的外源激素，pH值为4. 0 7. 0 ；所述的碳源为葡萄糖或蔗糖或果糖；氮源为硝酸铵或水解乳蛋白；生物诱导子为黑曲霉、米曲霉或蜜环菌诱导子；非生物诱导子为Ca2+、Mg2+或Co2+ ；外源激素为NAA或 6-BA。所述的毛状根液体基本培养基为MS培养基或采用以下配方包含大量元素、微量元素、铁盐和有机成分，pH为5. 8 6. 0 ；所述的大量元素为KNO3 :950mg/L、KH2PO4 :42. 5mg/L、MgSO4 · 7H20 185mg/L 和 CaCl2 · 2H20 220mg/L ；微量元素为KI :0. 83mg/L、H3BO3 :6. 2mg/L、MnSO4 · 4H20 :22. 3mg/L、ZnSO4 · 7H20 8. 6mg/L、Na2MoO4 · 2H20 :0. 25mg/L、CuSO4 · 5H20 :0. 025mg/L 和 CoCl2 :0. 025mg/L ；铁盐为Na2 · EDTA 18. 65mg/L 和 FeSO4 · 7Η2013· 9mg/L ；有机成分为肌醇100mg/L、甘氨酸Jmg/L、盐酸硫胺素0. lmg/L、盐酸吡哆醇 0. 5mg/L 和烟酸0. 5mg/L。所述的切取的根尖部分是按照5 8g/L的接种量接种到选育培养基中。所述的黄芩外植体的获得为将无菌的黄芩种子萌发后接种于含有0. 15 1. Omg/kg 6-BA和0. 1 0. 35mg/kg NAA的MS琼脂培养基上，在25 培养，生长成苗，切取苗的茎段作为外植体。所述的发根农杆菌的活化为将发根农杆菌的菌液均勻涂布于YEB琼脂培养基上，25°C培养，长出单菌落后，挑取单菌落于YEB液体培养基中，25°C、110r/min、黑暗条件下振荡培养2d ；然后再取菌体悬浮液转接种到YEB液体培养基中，25°C、110r/min、黑暗条件下振荡培养；YEB液体培养重复 2 3次，待农杆菌0D600为0. 4 0. 5时，用于感染黄芩外植体。所述的发根农杆菌为发根农杆菌A4、发根农杆菌A49615或发根农杆菌1. 2556。所述的抗菌素为氨苄西林钠，其浓度为180 500mg/kg。所述的筛选的黄芩毛状根株系，为黄芩苷含量可达毛状根干重4. 85%以上的株系。一种用于黄芩毛状根培养的优化培养基，是在毛状根液体基本培养基上添加 10 60g/L的碳源、0. 3 1. Og/L的氮源、20 100mg/L的生物诱导子、5. 3Χ1(Γ5 3. Ommol/L的非生物诱导子和0. 2 0. 6mg/L的外源激素，pH值为4. 0 7. 0 ；所述的碳源为葡萄糖或蔗糖或果糖；氮源为硝酸铵或水解乳蛋白；生物诱导子为黑曲霉、米曲霉或蜜环菌诱导子；非生物诱导子为Ca2+、Mg2+或Co2+ ；外源激素为NAA或 6-BA。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益的技术效果1、本专利技术公开的基于发根农杆菌感染的诱发黄芩毛状根的培育方法，通过发根农杆菌诱导黄芩属黄芩得到毛状根，诱导率可达10 40%，在经过固体、液体培养基的选育培养，所得黄芩毛状根呈黄色毛发状，能稳定合成黄芩苷，对其ITS测序，鉴定该毛状根为黄芩属黄芩毛状根。更进一步，本专利技术将黄芩属黄芩毛状根在优化培养基上培养，其生长迅速，在 30 35天其生物量能增值23 35倍，并且只需在黑暗条件下培养，低能耗，低成本，适合工业化生产。据文献报道的黄芩道地药材(产地河北承德)最高含量15. 89 士 1.52%，从单位时间黄芩苷生成量来看，经选育培养的毛状根系是药材黄芩的19 23倍。2、利用本专利技术培育的黄芩毛状根，遗传性状稳定，产生次生代谢产物能力强，可以有效合成黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷和汉黄芩素等药用成分，其中黄芩苷含量可达毛状根干重的4. 85 11. 85%，并且与黄芩药材有相同的糖苷键水解酶系。其中含量较高者比2005 版药典规定“药用黄芩含黄芩苷(C21H18O11)不得少于9.0%”有显著的提高。3、利用本本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种基于发根农杆菌感染的诱发黄芩毛状根的培育方法，其特征在于，包括以下步骤：１）将无菌的黄芩外植体接种于预培养基上，２５～２８℃黑暗条件下预培养２～３ｄ；所述的预培养基为含有０．１５～１．０ｍｇ／ｋｇ　６－ＢＡ和０．１～０．３５ｍｇ／ｋｇ　ＮＡＡ的ＭＳ固体培养基；２）在预培养的黄芩外植体上划痕，加入活化的发根农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）的菌液，并添加乙酰丁香酮，使其终浓度为２００～６００μｇ／ｍＬ，感染１０～３０ｍｉｎ；将黄芩外植体转移到ＭＳ固体培养基上，２５～２８℃黑暗培养２～３ｄ，再转移到含抗菌素的ＭＳ固体培养基上，２５～２８℃黑暗培养，诱发毛状根；３）待经发根农杆菌感染的黄芩外植体上长出的毛状根达到２～３ｃｍ时，在无菌条件下切下毛状根，将其转移到含抗菌素的ＭＳ固体培养基上，２５～２８℃黑暗培养，直至发根农杆菌生长被抑制，然后切取毛状根；４）将切取的毛状根接种于ＭＳ固体培养基上，２５～２８℃避光培养，每３０天继代培养一次；５）选取ＭＳ固体培养基继代培养２次以上、生长旺盛的毛状根，接种到ＭＳ液体培养基上，１００～２００ｒ／ｍｉｎ振荡、２５～２８℃避光培养，筛选生长迅速、能稳定产生黄芩苷的黄芩毛状根株系；６）选取ＭＳ液体培养基中生长旺盛的黄芩毛状根株系，切取根尖部分，接种到优化培养基上，１００～２００ｒ／ｍｉｎ振荡、２５～２８℃避光培养，培养到３２～３８ｄ补加培养液，培养至６０～８０天收获毛状根；所述的优化培养基是在毛状根液体基本培养基上添加１０～６０ｇ／Ｌ的碳源、０．３～１．０ｇ／Ｌ的氮源、２０～１００ｍｇ／Ｌ的生物诱导子、５．３×１０－５～３．０ｍｍｏｌ／Ｌ的非生物诱导子和０．２～０．６ｍｇ／Ｌ的外源激素，ｐＨ值为４．０～７．０；所述的碳源为葡萄糖或蔗糖或果糖；氮源为硝酸铵或水解乳蛋白；生物诱导子为黑曲霉、米曲霉或蜜环菌诱导子；非生物诱导子为Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋或Ｃｏ２＋；外源激素为ＮＡＡ或６－ＢＡ。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：齐香君，李雅，郭乐康，陈秀清，钱卫东，
申请(专利权)人：陕西科技大学，
类型：发明
国别省市：87