本发明专利技术涉及一种用于检测棘阿米巴原虫的环介导等温扩增引物及试剂盒，其引物序列分别为SEQ?ID?NO：1-4。本发明专利技术根据棘阿米巴基因保守区序列设计的环介导等温扩增引物能够灵敏、快速、安全的检测棘阿米巴原虫，同时本发明专利技术的试剂盒中采用UNG酶能彻底消除多次检测过程中核酸污染导致的假阳性，解决了限制环介导等温扩增技术广泛应用的易被污染干扰的问题。使用本发明专利技术的试剂盒在3小时内就可完成阿米巴性角膜炎中阿米巴原虫的检测，检测过程无需昂贵的仪器设备，仅需有水浴锅或金属浴和离心机即可；而且检测结果非常容易判别；与已有检测技术相比，本发明专利技术的试剂盒成本低，整个过程不涉及有毒试剂，对操作人员和环境都非常安全，并且检测灵敏度极高。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于常见病原微生物快速检测
，具体是涉及一种用于检测棘阿米巴原虫的环介导等温扩增引物及试剂盒。
技术介绍
棘阿米巴原虫是一种广泛存在于自然界中的自生生活的微生物，有滋养体、包囊两个时相。滋养体普遍栖息在淡水、污水、海水或泥土中，环境不利时转化为包囊，包囊可存在于空气中。在一定条件下，棘阿米巴原虫可从皮肤伤口、穿透性角膜外伤、损伤的眼结膜或经呼吸道、生殖道等进入人体，多数寄生于眼、皮肤等部位，若机体免疫力减弱还可进一步引发脑炎。棘阿米巴性角膜炎是一种顽固的进行性角膜溃疡，患者有异物感、视力模糊、 流泪、畏光，并常有严重疼痛，严重时可致盲。它的发生与一定的危险因素有关，主要包括配戴角膜接触镜、接触污染的水源和角膜外伤等。近年来由于角膜接触镜的佩戴，棘阿米巴性角膜炎有明显上升趋势。棘阿米巴性角膜炎表现复杂多样，在感染早期由于其临床症状和单疱病毒、真菌等引起的角膜感染非常相似，所以经常被误诊而延误治疗。而棘阿米巴引发的脑炎好发于免疫抑制的病人，感染前有过头部或眼部外伤，其诊断也是相当困难。神经系统体征显示局灶性单侧损害，有严重的局灶性坏死和水肿。患者头痛、发热呕吐、颈强直、眩晕、嗜睡、精神错乱、共济失调直至昏迷和死亡。对于棘阿米巴原虫目前常用的实验室诊断方法有病灶组织刮片检查、分离培养和共聚焦显微观察。病变组织刮片的显微观察具有快速简单，不需特殊仪器等优点，但是阳性率不高，而且对于阿米巴包囊的检出需要很有经验。对病变组织或刮片中阿米巴原虫的分离培养是一种很确切的检验方法，但是培养过程繁琐，切需要较长时间，这也制约了此方法的广泛应用。共焦显微镜直接观察病灶处有无阿米巴包囊是一种很直接的检测方法，是由于角膜组织的低光水平反射和眼球的运动限制了图像的生成，而且共焦显微镜也不是很普及的检测仪器。环介导等温扩增方法可弥补这些不足，目前尚未见用环介导等温扩增方法检测棘阿米巴原虫的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是要提供一种用于检测棘阿米巴原虫的环介导等温扩增(LAMP)引物及试剂盒，以便快速精确的检测棘阿米巴原虫，同时将检测试剂集中于规范的试剂盒中， 使棘阿米巴原虫的检测更准确、灵敏、快速、安全。本专利技术的检测棘阿米巴原虫的环介导等温扩增引物，其引物序列分别为SEQ ID NO :1 4。特殊设计的LAMP引物包括可以识别靶DNA六个不同序列的两个内引物(正向内引物和反向内引物)和两个外引物(正向外引物和反向外引物)，内引物包含靶DNA的正义链和反义链。本专利技术的棘阿米巴原虫核酸等温扩增检测试剂盒包括1)DNA提取裂解液；提取裂解液为STEN裂解液，STEN裂解液是由以下组份组成10%的十二烷基硫酸钠，1 10份；IOOmM PH值为8. 0的三羟甲基氨基甲烷，1 10份；IOmM的乙二胺四乙酸二钠，1 10份；IM氯化钠，1 10份；双蒸水定容到100份；2)蛋白酶K，内装20mg/mL蛋白酶K;3)蛋白抽提液，为体积比为25 24 1的酚氯仿异戊醇；4)核酸沉淀液，为无水乙醇；5)核酸洗涤液，为70 %的乙醇；6)纯水，为灭菌纯水；7) UNG酶，为尿嘧啶DNA糖基化酶；8) LAMP反应液，LAMP反应液由以下组份组成dATP、dGTP和dCTP各1. 0 2. OmM, dTTP、dUTP 各 0. 5 1. 5mM, Tris-HCl 10 40mM，KCl 5 20mM，(NH4) 2S045 15mM，Triton X-1000. 05% 1· 0%, MgS044 12mM, Betaine 0· 8 1· 6M ；9)引物混合液，内装序列分别为SEQ ID NO :1_4的LAMP正反向内引物和正反向外引物；10)Bst DNA 聚合酶，内装 8U/y 1 的 Bst DNA 聚合酶；11)显色剂，内装核酸染料GeneFinder 。本专利技术的试剂盒中还有阳性对照核酸，内装棘阿米巴原虫阳性DNA。本专利技术根据棘阿米巴基因保守区序列设计的LAMP引物能够灵敏、快速、安全的检测棘阿米巴原虫，同时本专利技术的试剂盒中采用UNG酶能彻底消除多次检测过程中核酸污染导致的假阳性，解决了限制LAMP技术广泛应用的易被污染干扰的问题。使用本专利技术的试剂盒在3小时以内就可完成阿米巴性角膜炎中阿米巴原虫的检测，检测过程无需昂贵的仪器设备如PCR仪和凝胶成像系统，仅需有水浴锅或金属浴和离心机即可；而且检测结果非常容易判别；与已有检测技术相比，本专利技术的试剂盒成本低，整个过程不涉及有毒试剂，对操作人员和环境都非常安全，并且检测灵敏度极高。具体实施例方式本专利技术设计了 4条特异引物并利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在一定温度下对核酸进行等温扩增。本专利技术的引物能有效检测棘阿米巴原虫的所有虫株，而且检测特异性好。另外本专利技术的试剂盒采用尿嘧啶糖基化酶消除LAMP扩增产物的污染，避免了由于LAMP检测方法的产物扩增量非常大，极易使被检样品污染，造成假阳性的结果，而大大限制了其在检测中的广泛应用；核心之三是优化了整个操作过程的技术参数，并将之标准化、配套化，形成检测试剂盒，以便于现场应用。下面对本专利技术的引物和试剂盒进行具体的描述。棘阿米巴原虫核酸等温扩增检测试剂盒的制备本专利技术的试剂盒由以下组成(5样份)(1) DNA提取裂解液，1管，内装500 μ 1 STEN裂解液，STEN裂解液是由以下组份组成10%的十二烷基硫酸钠(SDQ 10份；IOOmM的三羟甲基氨基甲烷(Tris · HC1，ρΗ8. 0) 10 份；IOmM的乙二胺四乙酸二钠(EDTA) 10份；IM氯化钠(NaCl) 10份；双蒸水定容到100份；(2)蛋白酶K，1管，内装5μ1蛋白酶K(20mg/mL)；(3)核酸抽提液，1管，内装500 μ 1酚氯仿异戊醇05 24 1)；(4)核酸提取液，1管，内装1000 μ 1无水乙醇；(5)核酸洗涤液，1管，内装1000 μ 170%的乙醇；(6)灭菌纯水，1管，内装200 μ 1灭菌纯水；(7) UNG酶，1管，内装25U的尿嘧啶DNA糖基化酶；(8) LAMP反应液，1管，内装80 μ 1 LAMP反应液，LAMP反应液由以下组份组成 dATP、dGTP 和 dCTP 各 1. 4mM，dTTP、dUTP 各 0. 7mM, Tris-HC120mM, KCl IOmM, (NH4) 2SO4IOmM, Triton X-1000. 1 %, MgS048mM, BetainelM ；(9)引物混合液，1管，内装20 μ L LAMP正反向内引物各10 μ M和正反向外引物各 1. 25μΜ ；(IO)Bst DNA聚合酶，1 管，内装 5μ L 8U/μ 1 的 Bst DNA 聚合酶；(11)显色剂，1管，内装5 μ 110倍稀释核酸染料GeneFinder ；(12)阳性对照核酸，1管，内装10 μ 1棘阿米巴原虫阳性DNA ；试剂盒中所述的LAMP引物的DNA序列分别为SEQ ID NO 1 4。本专利技术的棘阿米巴原虫的LAMP检测方法，可用于棘阿米巴性角膜炎中阿米巴原虫的检测，还可用于检测水体、食物中是否存在阿米巴原虫。具体步骤如下(1)取待测样品置于微型离心管中，加入100本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种用于检测棘阿米巴原虫的环介导等温扩增引物，其引物序列分别为ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～４。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：赵格，谢立信，孙士营，陈豪，
申请(专利权)人：山东省眼科研究所，
类型：发明
国别省市：95
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