本发明专利技术公开了一种利用废渣固态发酵生产脂肪水解酶的制备方法，属于微生物发酵领域。发明专利技术将黑曲霉RFW-5接种到发酵培养基中，在接触空气条件下，于温度35~42°C，环境相对湿度75~80%固态发酵，培养3天达到产酶高峰。用pH为7.0，100mM的磷酸缓冲液浸提培养物，离心，上清液即脂肪水解酶溶液。经滴定法测定酶活，脂肪水解酶活达到32.3单位/克干固体。本发明专利技术制备的脂肪水解酶所用原料价廉，酶产率高，发酵周期短，工艺简单，具有很高的工业化开发价值；并且为高浓度油脂污水的处理提供了一条新途径。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及，更确切地说是涉及一种采用黑曲霉菌RFW-5作为菌种对废渣进行固态发酵生产脂肪水解酶的方法。
技术介绍
来自屠宰场，奶制品加工厂和餐饮业污水中含有大量难生物降解的油脂。高浓度的油脂会对后续处理产生一系列问题，如降低传质效率、丝状细菌大量繁殖进而导致沉降困难、污泥上浮、堵塞管网和产生恶臭气体等。脂肪水解酶是一种酶制剂，它的主要作用是水解脂肪，将脂肪水解为甘油和脂肪酸。大量学者(如巴西的 Denise M. G. Freire、Magali C. Cammarota、Daniela R. Rosa 等人)研究发现，利用脂肪水解酶处理油脂污水会提高整个反应系统的去除效率，进而得到较好的出水。巴西的学者Denise M. G. Freire，利用棕榈油饼废弃物为底物，经从环境中分离的黑曲霉菌(Penicillium sp. fungus)在温度35° C、环境相对湿度75%条件下发酵，得到了 20U/g的酶活。然后将发酵物以0. l%(w/v)的接种量接种到1200mg/L的油脂污水中，30° C处理M小时后，游离脂肪酸浓度比初始时高了 8倍。将经发酵物处理过的油脂污水用厌氧反应器继续处理，发现COD去除率90%左右，而该厌氧反应器对原水的COD去除率只有32%。因此，脂肪水解酶在油脂污水的生物降解中有重要应用。目前商业化的脂肪水解酶使用液体深层发酵获得的比较多，虽然纯度高，但价格昂贵限制了其广泛应用。与液体深层发酵相比，通过固态发酵生产脂肪水解酶可能更为合适(Mitchell et al.，2002; Pandey, 2003)。固态发酵(SSF)过程中使用的水较少，从而有以下优点首先，发酵罐的体积大幅度缩小，容积利用率更高；发酵结束后，产品浓度高， 产物干燥后就可以直接使用；污水产生量少，进而处理费用低(Castilho et al. , 2000)。 微生物，特别是丝状真菌，固态发酵(SSF)条件与它们的自然生境相似，所以可以获得最大数量的酶。另外，固态发酵所用培养基可以是糠，麸和其它来自于植物的复合物质。因此， 发酵培养基几乎不需要其它添加的营养物质。上面所述的物质都是工农业废弃物，所以廉价充足。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供。利用废渣固态发酵生产脂肪水解酶的制备方法是将黑曲霉RFW-5接种到发酵培养基中，在接触空气条件下，于温度35、2° C，环境相对湿度75、0%固态发酵，培养3天达到产酶高峰，用PH为7. 0，IOOmM的磷酸缓冲液浸提培养物，离心，上清液即脂肪水解酶溶液；所述的的发酵培养基组成为重量百分比为10. 0 14. 0%的豆饼，重量百分比为8. 0 11. 0%的甘蔗渣，重量百分比为10. 0 14. 0%的花生饼，补充溶液61. 0 72. 0 %L/kg。所述的黑曲霉RFW-5保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2010年12月10日；保藏编号CGMCC No. 4450 ；分类命名黑曲霉Asper识 niger。所述的大豆饼为大豆油生产过程中产生的废渣，经脱水干燥加工成含水率在12%以下，再经粉碎处理能过20目筛的颗粒。所述的甘蔗渣为甘蔗在经人类食用后产生的甘蔗废渣，经脱水干燥加工成含水率在12%以下，再经粉碎处理能过100目筛的颗粒。所述的花生饼为花生油生产过程中产生的废渣，经脱水干燥加工成含水率在13%以下，再经粉碎处理能过20目筛的颗粒。所述的的补充溶液成份为=NaCl 3. 0 5. 0g，KH2PO4 0. 1 0. 3g， MgSO4 ·7Η20 0. 05 0. lg，K2HPO4 L 2 1. 5g, (NH4)2SO4 0· 8 1. 0g,Tween80 15 20mL, 食用油4 5mL，蒸馏水1000mL。本专利技术制备的脂肪水解酶所用原料价廉，酶产率高，发酵周期短，工艺简单，具有很高的工业化开发价值；并且为高浓度油脂污水的处理提供了一条新途径。具体实施例方式实施例1 固态发酵生产脂肪水解酶实验1本专利技术所用黑曲霉菌RFW-5是从环境中分离、筛选获得，目前已将其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2010年12月10日；保藏编号CGMCC No. 4450 ；分类命名黑曲霉 Asper^iV^As niger。发酵培养基组成为重量百分比为10. 0%的豆饼，重量百分比为8. 0%的甘蔗渣，重量百分比为10.0%的花生饼，补充溶液72.0 % (L/kg)。大豆饼为大豆油生产过程中产生的废渣，经脱水干燥加工成含水率在12%，再经粉碎处理能过20目筛的颗粒；甘蔗渣为甘蔗在经人类食用后产生的甘蔗废渣，经脱水干燥加工成含水率在12%，再经粉碎处理能过100 目筛的颗粒；花生饼为花生油生产过程中产生的废渣，经脱水干燥加工成含水率在13%，再经粉碎处理能过20目筛的颗粒；补充溶液成份为=NaCl 3. 0g, KH2PO4 0. lg, MgSO4 · 7H20 0. 05g, K2HPO4 1. 2g, (NH4)2SO4 0. 8g, Tween80 15mL，食用油 4mL，蒸馏水 IOOOmL。固态发酵操作方法如下按发酵培养基所述的原料比配制培养基，培养基分装于 IOOmL的三角瓶中，每瓶30g，于121° C高压灭菌30分钟；接种黑曲霉菌RFW-5，于温度 35° C，环境相对湿度75%、接触空气条件下，静置培养3天；用pH为7. 0，IOOmM的磷酸缓冲液浸提培养物(在200rpm，37° C振摇30min)，1600 X g离心2min，上清液即脂肪水解酶溶液。脂肪水解酶酶活测定采用滴定法。测定方法具体如下取ISmL的含有5%(w/v)阿拉伯胶和5%(w/v)橄榄油的pH 7. OUOOmM的磷酸缓冲溶液于IOOmL三角瓶中，加入2mL脂肪水解酶液。置于200rpm，37° C摇床中振摇15min。通过添加20mL丙酮和乙醇(1:1 ν/ ν)的混合物终止反应。然后再次将其放入200rpm、37° C摇床中振摇IOmin以使游离脂肪酸分离出来。添加2低酚酞试剂，然后使用O.Olmol/L的NaOH滴定至红色pH 10.0。空白对照为先将2mL脂肪水解酶液加入到20mL丙酮和乙醇(1:1 ν/ν)的混合物中，再将该混合物加入到含有相同底物的IOOmL三角瓶中。1单位酶活定义为实验条件下，每分钟能催化产生IMfflol脂肪酸的酶数量。经测定本次固体发酵实验获得的脂肪水解酶酶活为27. 5单位/克干固体。实施例2 固态发酵生产脂肪水解酶实验2本专利技术所用黑曲霉菌RFW-5是从环境中分离、筛选获得，目前已将其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2010年12月10日；保藏编号CGMCC No. 4450 ；分类命名黑曲霉 Asper^iV^As niger。发酵培养基组成为重量百分比为14. 0%的豆饼，重量百分比为11. 0%的甘蔗渣， 重量百分比为14.0%的花生饼，补充溶液61.0 %(L/kg)。大豆饼为大豆油生产过程中产生的废渣，经脱水干燥加工成含水率在12%，再经粉碎处理能过20目筛的颗粒；甘蔗渣为甘蔗在经人类食用后产生的甘蔗废渣，经脱本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种利用废渣固态发酵生产脂肪水解酶的制备方法，其特征将黑曲霉ＲＦＷ－５接种到发酵培养基中，在接触空气条件下，于温度３５～４２°Ｃ，环境相对湿度７５～８０％固态发酵，培养３天达到产酶高峰，用ｐＨ为７．０，１００ｍＭ的磷酸缓冲液浸提培养物，离心，上清液即脂肪水解酶溶液；所述的的发酵培养基组成为：重量百分比为１０．０～１４．０％的豆饼，重量百分比为８．０～１１．０％的甘蔗渣，重量百分比为１０．０～１４．０％的花生饼，补充溶液６１．０～７２．０ ％Ｌ／ｋｇ。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：梁志伟，陈英旭，刘国防，王云龙，杨尚源，
申请(专利权)人：浙江大学，杭州波易环保技术有限公司，
类型：发明
国别省市：86
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