本发明专利技术公开了一种猪小肠抗菌肽PR-39在毕赤酵母中的高效生产方法及应用。本发明专利技术根据毕赤酵母的偏嗜性合成编码PR-39的DNA序列，连接表达载体pGAPZαA，构建pGAPZαA-PR-39真核表达载体；转化重组表达载体至宿主细胞，构建表达工程菌；发酵培养重组酵母菌，进行表达。本发明专利技术应用基因工程技术在毕赤酵母宿主细胞中高效表达了抗菌肽PR-39，表达效率高，分离纯化简单，生产成本低，易放大，稳定性好，适于大规模工业化生产，在制备抗菌药物、饲料添加剂或食品防腐剂方面具有广阔的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程
，具体涉及抗菌肽的表达，尤其是涉及猪小肠抗菌肽PR-39的高效生产方法。
技术介绍
目前，几乎所有的常规抗生素都出现了相应的抗药性致病株系，致病菌的耐药性问题已经日益严重地威胁着动物和人类的健康，同时生物安全和食品安全已经引起人类的重视，寻找全新类型的抗菌剂是解决抗药性问题的一条有效途径。抗菌肽是生物界中广泛存在的一类生物活性小肽，是一种由微生物、植物、无脊椎动物和各种动物的细胞和组织产生的一种抗菌活性多肽，也是生物体内先天免疫系统中的重要组成部分。现在发现抗菌肽广泛分布于细菌、昆虫、植物、两栖动物和哺乳动物中，它具有广谱抗菌、抗病毒、杀肿瘤细胞、热稳定、强碱性、易溶于水和带正电荷等特点，相对分子质量低及对真核细胞几乎没有毒不良反应。并且抗菌肽的抗菌浓度小，抗菌浓度单位一般在ymol/ L水平，可作为传统抗生素的替代品，是一种具有巨大发展前景的新型抗菌剂。PR-39是1991年Agerberth. B等人从猪小肠组织中分离纯化出来，在骨髓原代细胞中合成，以前肽形式储存在中性粒细胞中，成熟肽含有39个氨基酸残基，其中22个脯氨酸(《，11个精氨酸00，故称其为？1 -39，分子量约为4.71^。其前体是一条编码173个氨基酸残基的基因，其基因结构相当紧凑，仅由1784bp组成，具有4个外显子和3个内含子， 1993年Morici. P等首次从猪骨髓细胞中克隆到PR-39的cDNA。PR-39具有广谱抗菌活性、抗癌抗肿瘤作用、嗜中性粒细胞趋化作用以及较强血管生成和组织修复作用，且无不良反应，是一种具有预防和治疗疾病潜能的肽类抗生素。但是，直接从猪的组织中提取天然PR-39，分离纯化存在一定的困难，而且产量低， 不能满足生产需求。化学合成和基因工程法是获得猪小肠抗菌肽PR-39的主要手段，但化学合成PR-39成本高，而通过基因工程在微生物中表达抗菌肽基因是获得PR-39的有效途径。目前，PR-39基因在大肠杆菌、兔骨髓介质干细胞和四31~细胞中获得表达，但是表达量低、难纯化、生产工艺复杂。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有PR-39基因表达量低、难纯化、生产工艺复杂等缺陷， 提供一种采用毕赤酵母表达系统高效表达猪小肠抗菌肽PR-39的方法。本专利技术的目的通过以下技术方案予以实现提供一种采用毕赤酵母表达系统高效表达猪小肠抗菌肽PR-39的方法，包括以下步骤(1)根据GenBank 上发表的抗菌肽冊39氨基酸序列，选用毕赤酵母偏嗜性密码子，设计4条互为模板的引物，PCR合成编码PR-39的DNA序列，连接表达载体 PGAPZ α -Α,构建pGAPZ α -A-PR-39真核表达载体；所述引物Pl、p2、P3和P4分别具有SEQID No. USEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3 和 SEQ ID No. 4 所示的核苷酸序列；(2)重组表达载体pGAPZ α -A-PR-39转化宿主细胞毕赤酵母，构建表达工程菌； 具体是将感受态 A/^asioril5 SMDl 168 (80 μ L)与 Avr II 线性化的 pGAPZ α-A-PR-39 (10 μ g)相混合，1.5 kV、200Q电击5毫秒(ms)。将转化后的酵母细胞铺于新鲜制备的 YPDS平板(含100 μ g/ml Zeocin)上，将平板倒置，于30°C温箱中培养至单菌落出现(需要 3 5天)。采用100°C煮(IOmin)—-20°C冻(IOmin)—-20°C煮(IOmin)和细胞壁破碎法制备PCR模板分析A pas toris转化子，以P1、P4为引物进行PCR，PCR反应条件94 V预变性 5min ；94°C变性30s，52°C退火30s，72°C延伸45s，25个循环之后，72°C再延伸IOmin ；扩增出142 bp的克隆的菌株定为阳性转化子。再经不同浓度(10(^8/1111，20(^8/1111，40(^8/ ml) Zeocin的YPD平板挑选高拷贝克隆，以用于高效表达目的蛋白。(3)发酵培养重组酵母菌，进行表达；具体是用灭菌牙签细挑筛选到的具有&0(^11抗性的单菌落，挑于5 mL的YPD液体培养基中进行一级培养，30°C，200 r/min振荡过夜，至0D600=2飞，此时细胞处于对数生长期。取1 mL—级培养液，重悬于30 mL的YPD中，继续振荡培养，用四层干净的纱布外加两层报纸包扎，培养约72小时；(4)表达产物纯化得到猪小肠抗菌肽PR-39。具体是将表达产物3000 r/min离心5min，取上清液即为抗菌肽PR-39。本专利技术方法制备得到的抗菌肽PR-39可以应用于制备抗菌药物。本专利技术的有益效果是本专利技术创造性地选择了毕赤酵母菌作为猪小肠抗菌肽PR-39真核表达宿主，获得较高的表达量，具有比大肠杆菌等其他表达系统更完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰及分泌能力，且不会产生内毒素；本专利技术进一步采用pGAPZ α-A真核表达载体和蛋白酶缺陷型菌株SMD1168构建表达工程菌，有效避免产物被蛋白酶降解，不需甲醇诱导，所表达异源蛋白直接分泌到培养基中，大大减少了对培养基中的外源基因表达产物的纯化工作(简单离心处理即可)，且显著提高表达量。本专利技术方法简单易行，采用的培养基等材料价格低廉，更利于实现工业化推广生产。本专利技术应用基因工程技术在真核宿舍细胞中高效表达了抗菌肽PR-39，经实验验证该抗菌肽对多种革兰氏阳性菌有杀菌作用，且本专利技术表达效率高，分离纯化简单，生产成本低，易放大，稳定性好，适于大规模工业化生产。因此，本专利技术在制备新型抗菌药物具有广阔的应用前景。附图说明图1猪小肠抗菌肽PR-39对金黄色葡萄球菌的抑菌作用其中1为空载体表达上清液阴性对照，2为氨苄青霉素(Amp)阳性对照，3、4为抑菌圈；图2猪小肠抗菌肽PR-39对猪水肿病大肠杆菌的抑菌作用其中1为空载体表达上清液阴性对照，2为Amp阳性对照，3、4为抑菌圈；图3猪小肠抗菌肽PR-39表达上清蛋白的SDS-PAGE电泳图其中M为超低分子量蛋白 marker, 1、2为表达上清。具体实施例方式下面结合附图和具体实施例进一步说明本专利技术。除非特别说明，本专利技术实施例采用的试剂、原料等均为常规的试剂、原料等，实施例采用的方法特别说明，皆为本
常规方法。实施例1(1)构建表达载体=GenBank上发表的抗菌肽冊39氨基酸序列，选用毕赤酵母偏嗜性密码子，设计4条互为模板的引物，通过两轮PCR，以P2、P3引物进行第一轮 PCR扩增，PCR反应条件:94°C预变性5min ；94°C变性30s, 52°C退火30s, 72°C延伸45s，30 个循环之后，72°C再延伸IOmin ；以回收的第一轮PCR产物为模板，以PI、P4为引物进行第二轮PCR扩增，PCR反应条件同第一轮相同，产物即为目的基因。获得的PR-39的基因连接到表达载体上，获得重组表达载体所述引物的核苷酸序列如下Pl:5’ - CCCTCGAGAAGAGA AGA AGAAGACCAAGACCACCATACTTGCCAAGACC -3’ ， p2:5’ - CA A TCT TGG TGGGAA GAATGGTGGTGGTCT TGGT本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种猪小肠抗菌肽ＰＲ－３９在毕赤酵母中的高效生产方法，其特征在于包括以下步骤：（１）根据ＧｅｎＢａｎｋ ［ＧＩ：２４２３０４］ 上发表的抗菌肽ＰＲ３９ 氨基酸序列，选用毕赤酵母偏嗜性密码子，设计４条互为模板的引物，ＰＣＲ合成编码ＰＲ－３９的ＤＮＡ序列，连接表达载体ｐＧＡＰＺα－Ａ，构建ｐＧＡＰＺα－Ａ－ＰＲ－３９真核表达载体；所述引物Ｐ１、ｐ２、Ｐ３和Ｐ４分别具有ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ２、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ３和ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ４所示的核苷酸序列；（２）重组表达载体ｐＧＡＰＺα－Ａ－ＰＲ－３９转化宿主细胞毕赤酵母，构建表达工程菌；（３）发酵培养重组酵母菌，进行表达，得表达产物；（４）将步骤（３）所述表达产物离心处理得到纯化的猪小肠抗菌肽ＰＲ－３９。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：黄毓茂，何俊，刘德辉，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：81
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