本发明专利技术公开了一种骨髓间充质亲干细胞亲和多肽的氨基酸序列、筛选方法及应用，属于生物制药领域。所述筛选方法包括以下步骤：采用噬菌体展示技术分别进行人成纤维细胞阴性筛选和骨髓间充质干细胞的阳性筛选；筛选之后，提取骨髓间充质干细胞，裂解细胞，再提取和骨髓间充质干细胞特异性亲和的噬菌体片段，对其进行测序，即可获取对骨髓间充质干细胞具有高度亲和性的多肽片段。本发明专利技术能够提高生物材料对于骨髓间充质干细胞特异性亲和能力，在组织工程软骨修复领域里有着深远的意义和广泛的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医学领域，特别涉及一种骨髓间充质亲干细胞亲和多肽的氨基酸序列、筛选方法及应用。
技术介绍
经过近20年的发展，组织工程(Tissue Engineering, TE)术已经广泛地应用于临床的各个领域，包括骨组织、软骨、神经、血管、皮肤以及胃肠道和泌尿生殖系统的再生和修复。在组织工程的发展过程中，针对各种组织的支架的不断改进和更新是关键，包括材料的更新、制作方法的改进以及构建理念的不断创新。而近期组织工程学另一个比较明显的理念上的转变，就是“化繁为简”，即与其在体外通过各种复杂的手段和技术来尽可能地去模拟正常组织的组成，然后再植入体内，不如为人体提供一个自我修复的支架，让人体这个天然的“生物反应器”依附这个支架来进行自我修复。因为人体内环境是十分复杂的，所以才会导致很多实验设想与结果相差很大，并且支架植入步骤的繁复也会限制其在临床上的推广和应用。但这样的支架就要求根据需要来进行特定的修饰，从而起到诱导特定细胞粘附、 增殖和分化的作用。正常组织中，细胞周围基质对细胞的生物功能具有重要的意义，通过基质中的蛋白或多肽分子的功能结构域与细胞表面受体结合，激活细胞内复杂的信号通路，对细胞的基因表达、粘附、迁移、增殖以及分化等生物学功能进行调控，而这些功能域也许仅仅只有几个氨基酸片段的长度。这种调控方式，为我们构建活性多肽序列，对组织工程支架进行表面修饰，以模拟细胞周围基质对细胞本身的调控功能提供了理论依据。采用不同类型的多肽对支架进行修饰，也赋予支架不同的生物功能。有研究表明，采用细胞周围基质蛋白对人工支架进行表面修饰，可提高细胞对支架的贴附率和增殖率，进一步的研究发现，在这些细胞周围基质蛋白中，纤粘连蛋白(fibronectin)是促进细胞贴附、迁移的主要成分。实际上，真正影响细胞生物功能的只是纤粘连蛋白中几个氨基酸片段构成的功能域。例如，采用 RGD多肽对支架进行修饰，即可提高肌细胞对支架的贴附率，也提高了细胞的增殖效率，说明仅需三个氨基酸片段长度的结构域就能对细胞功能产生显著影响。Duan等4人也有类似的发现，利用角膜细胞特异亲和性多肽序列对支架进行修饰后，可提高角膜上皮细胞对支架的贴附率，并诱导角膜细胞在支架上分层排列，出现类似于生理情况下的组织结构。同时，利用多肽对支架进行修饰，也可调控蛋白分子在组织工程支架上的聚集，Ryadnov等人利用多种多肽片段构建的小分子蛋白对支架进行修饰，利用多肽对特定蛋白分子表现出的亲和性，赋予支架捕获这些蛋白分子的功能，使蛋白分子在支架周围富集，进而调控支架内细胞的生物学功能。Siah等人利用TGF-β高度亲和的多肽序列对多肽兼性分子纳米支架 (PA)进行修饰，极大提高了支架对软骨缺损的修复效果，这种支架对干细胞向软骨定向分化的诱导能力大大增强，粘多糖的表达程度也显著提高。说明多肽修饰后的支架，可装载、 保护，并缓释生长因子，这种缓释作用，与支架的降解时间以及亲和多肽对支架的修饰程度密切相关，当修饰程度为5%-10%时，植入体内第4周后，支架仍能发挥优良的生长因子缓释功能。而且最关键的是，装载外源性TGF-β和没有转载外源性TGF-β的支架对软骨缺损的最终修复效果没有显著差别，这说明这种TGF-β亲和多肽修饰后的支架，在没有装载外源性生长因子的情况下，可大量富集内源性的TGF-β生长因子，改善支架内的微环境， 实现诱导干细胞向软骨分化的功能。骨髓间充质干细胞做为一种存在骨髓组织中，具有多向分化潜能的干细胞早在上世纪六十年代就由Friedenstein等提出，并对其细胞学特性进行了一定的研究，之后每年都有大量的相关研究结果发表，尤其是近二十年，随着组织工程和再生医学的迅速发展，对种子细胞的需求促使对各种干细胞的研究更加深入。目前，骨髓间充质干细胞的多向分化潜能已经被大量的研究所证实，并且因为其所具有的增殖活性强以及多向分化的特性，已被广泛地应用于心肌、神经、肝脏、胰腺、骨组织以及软骨再生等组织工程领域的各个角落。在实现本专利技术的过程中，专利技术人发现现有技术至少存在以下问题现有技术中还没有一种能够提高生物材料对于骨髓间充质干细胞特异性亲和能力的骨髓间充质亲干细胞亲和多肽的筛选方法。
技术实现思路
本专利技术实施例的目的是针对上述现有技术的缺陷，提供一种能够提高生物材料对于骨髓间充质干细胞特异性亲和能力的骨髓间充质亲干细胞亲和多肽的筛选方法。本专利技术另一目的提供骨髓间充质亲干细胞亲和多肽的氨基酸序列。本专利技术又一目的提供骨髓间充质亲干细胞亲和多肽的应用。为了实现上述目的本专利技术采取的技术方案是一种利用改进的噬菌体展示技术筛选能够提高生物材料对于骨髓间充质干细胞特异性亲和能力的骨髓间充质亲干细胞亲和多肽的方法，包括以下步骤(1)人骨髓间充质干细胞以及人成纤维细胞原代培养通过人骨髓间充质干细胞的原代培养并传一代，获得阳性筛选细胞；通过人成纤维细胞的原代培养并传十代以上，获得阴性筛选细胞；(2)阴性筛选在阴性筛选细胞中加入噬菌体文库，去除噬菌体文库中与PlO代 ACL成纤维细胞结合的多肽片段；(3)阳性筛选在阳性筛选细胞中加入步骤⑵中阴性筛选后得到的噬菌体多肽文库菌液，获得经阳性筛选后的骨髓间充质干细胞，该细胞结合了噬菌体文库中与其特异性结合的亲和多肽片段；(4)噬菌体扩增提取步骤3所得骨髓间充质干细胞，制备细胞裂解液，对其内的噬菌体滴度进行扩增；(5)测量扩增后的噬菌体提取液的滴度，4°C保存；以上(1) ( 步骤重复4轮，第1轮筛选加入噬菌体文库原液，以后每轮加入前一轮细胞裂解液扩增后的噬菌体提取液；(6)提取每一轮所得的和骨髓间充质干细胞特异性亲和的噬菌体DNA片段，进行测序，筛选出对骨髓间充质干细胞具有高度亲和性的多肽序列即序列表中的SEQ ID NO. 1EPLQLKM，其DNA序列如序列表中的SEQ ID NO. 2所示GAGCCGCTGCAGCTGAAGATG。本专利技术的另一技术方案是骨髓间充质亲干细胞亲和多肽修饰植入人体支架的应用及其修饰方法，包括以下步骤将选出的骨髓间充质干细胞亲和多肽的3’ C末端，连接一个半胱氨酸(C)，利用该半胱氨酸(C)残基与聚己内酯(PCL)电纺丝膜经氨化后的表面-NH2 共价耦联，使得PCL纳米纤维膜支架具有特异性富集骨髓间充质干细胞的性能。具体包括以下步骤1)将PCL纳米纤维膜置于异丙醇配置的10% w/v的1，6_己二胺中，37°C，放置 lh；2)通过交联齐环己烷-1-羧基磺基琥珀酰亚胺将PCL纳米纤维膜表面的氨基和亲和多肽相连接。更具体的步骤为1)将PCL纳米纤维膜修剪成与M孔板的孔面积相等的圆形，然后将其放入M孔板的孔内，每孔加入500 μ 1的10% w/v的1，6_己二胺/异丙醇溶液，37°C，放置Ih ；2)去离子水漂洗3 5遍，双蒸水漂洗3 5遍，PBS (0. 01M, pH 7. 4)冲洗3遍；3)每孔加入400 μ 1的交联剂4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸_3_磺基琥珀酰亚胺酯(lmg/ml SMCC, Thermo公司)，室温下放置Ih ；4)用含 EDTA 的缓冲液(500ml 0. 01M/pH 7. 4 的 PBS+18. 612gEDTA，pH 7. 2 7. 5) 冲洗3遍5)加入0本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种骨髓间充质亲干细胞亲和多肽氨基酸序列，其特征在于，所述氨基酸序列为序列表中的ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：敖英芳，邵振兴，皮彦斌，张辛，周春燕，
申请(专利权)人：北京大学第三医院，
类型：发明
国别省市：11
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