犬流感重组病毒及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开一种犬流感重组病毒，该重组病毒包含：ZJCIV犬流感病毒的HA和NA基因、以及PR8病毒的PA、PB1、PB2、M、NP和NS六个内部基因。本发明专利技术还公开了犬流感重组病毒的制备方法及应用。本发明专利技术的犬流感重组病毒，在鸡胚和MDCK细胞上均能产生很高的病毒滴度和血凝滴度，可作为研制犬流感疫苗的优良种毒。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物工程
，尤其涉及一种犬流感重组病毒及其制备方法和应用。
技术介绍
A型流感病毒是一类威胁人类健康的重要传染病。流感病毒具有严格的宿主特异性，即便是相同病毒在不同的宿主上的传播也受到宿主界限制。早在2004年，美国首次报道H3N8亚型犬流感病毒引起犬流感的大爆发，通过序列分析，发现该亚型的犬流感病毒是从马流感病毒衍变而来的。随后，澳大利亚发生马流感后也爆发犬流感病毒。2008年，韩国爆发了由H3N2亚型犬流感病毒引起的犬流感，通过序列分析，发现H3N2亚型的犬流感病毒是禽源的，不同于欧美国家的马源犬流感病毒。2006-2007年间，中国华南地区发病犬体内分离获得数株H3N2亚型犬流感病毒， 通过序列分析，发现这些病毒与韩国分离到病毒高度同源。对华南地区宠物狗的血清进行调查发现，6. 7%的狗血清呈流感阳性。2010年，本实验室从华东地区也分离获得一株犬流感病毒，命名为A/canine/aiejiang/OlAOlOOKN〗亚型，简称ZJCIV)。对ZJH3病毒的全基因组序列分析发现，该病毒与华南及韩国H3N2犬流感病毒高度同源。动物感染实验发现 ZJH3病毒可以感染狗，并可以引起犬发病，表现为食欲下降、高热、咳嗽和鼻腔中排出脓性分泌物等症状，解剖后发现肺淤血、出血，肺泡中充满炎性渗出物。2009年6月，Intervet公司研究成功犬流感病毒灭活苗，在美国已经上市，但是我国流行的犬流感病毒与美国流行的犬流感病毒抗原性差别很大，二者起源于不同的H3流感病毒分支。因而，研制针对我国犬流感病毒流行株的灭活疫苗，对于犬流感的预防控制具有重要的实际意义。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种犬流感重组病毒，其包含犬流感病毒ZJCIV 的HA和NA基因、以及PR8病毒的6个内部基因，该重组病毒能制成更适用于亚洲地区的犬流感病毒灭活苗。此外，还需要提供一种上述犬流感重组病毒的制备方法和应用。为了解决上述技术问题，本专利技术通过如下技术方案实现在本专利技术的一个方面，提供了一种犬流感重组病毒，该重组病毒包含ZJCIV犬流感病毒的HA和NA基因、以及PR8病毒的PA、PB1、PB2、M、NP和NS六个内部基因，所述犬流感病毒HA基因的核苷酸序列选自(1)编码SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列的核苷酸序列；(2)编码与SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列具有98%以上同源性的氨基酸序列的核苷酸序列；所述犬流感病毒NA基因的核苷酸序列选自3(1)编码SEQ ID NO. 2所示氨基酸序列的核苷酸序列；(2)编码与SEQ ID NO. 2所示氨基酸序列具有98%以上同源性的氨基酸序列的核苷酸序列。优选的，所述犬流感病毒HA基因具有SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列，或者所述犬流感病毒HA基因具有与SEQ ID NO. 3所示核苷酸序列具有98%以上同源性的序列。优选的，所述犬流感病毒NA基因具有SEQ ID NO. 4所示的核苷酸序列，或者所述犬流感病毒NA基因具有与SEQ ID N0. 4所示核苷酸序列具有98%以上同源性的序列。在本专利技术的另一方面，还提供了一种上述犬流感重组病毒的制备方法，包括以下步骤构建分别包含ZJCIV犬流感病毒HA基因和NA基因的重组质粒；将所述HA基因的重组质粒和NA基因的重组质粒，与分别包含PR8病毒PA、PBl、 PB2、M、NP、NS内部基因的六个质粒一起转染细胞，培养转染后的细胞；将培养的细胞上清接种于鸡胚，在孵化器内培养合适时间后，收获鸡胚尿囊液，检测该尿囊液的血凝性，如果有血凝活性，并且经过序列分析确定没有非预期突变后，即获得犬流感重组病毒。优选的，将培养的细胞上清接种于9-11日龄鸡胚，在37°C孵化器内培养48-72小时后，收获鸡胚尿囊液。所述重组质粒采用PBD载体作为空载体。在本专利技术的另一方面，还提供了一种上述犬流感重组病毒在制备预防或治疗犬流感的病毒灭活疫苗中的应用。在本专利技术的另一方面，还提供了一种流感疫苗，该疫苗以上述犬流感重组病毒为种毒而制成。本专利技术犬流感重组病毒，在鸡胚和MDCK细胞上均能产生很高的病毒滴度和血凝滴度，可作为研制犬流感疫苗的优良种毒。附图说明下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步详细的说明。图1是本专利技术实施例1犬流感病毒ZJCIV的HA和NA的RT-PCR电泳图；图2是本专利技术实施例3救获的重组病毒和ZJCIV接种鸡胚后不同时间的血凝效价图；图3是本专利技术实施例3救获的重组病毒和ZJCIV在鸡胚上生长曲线比较图；图4是本专利技术实施例3救获的重组病毒和ZJCIV接种MDCK细胞后不同时间的血凝效价图；图5是本专利技术实施例3救获的重组病毒和ZJCIV在MDCK细胞上生长曲线比较图。 具体实施例方式下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《精编分子生物学实验指南》(F.M.奥斯伯，R.E.金斯顿，J.G.塞德曼等主编，马学军，舒跃龙的译.北京 科学出版社，2004)中所述的方法进行。犬流感病毒灭活疫苗研制的重要前提之一是有优良的种毒，本实验室之前分离到的A/canine/aiejiang/01/2010病毒(H3N2亚型，简称ZJCIV)无论在鸡胚上还是在细胞上扩增后，血凝滴度均非常低。为此，本专利技术将ZJCIV犬流感病毒主要的抗原蛋白HA、NA基因与PR8病毒其余六个内部基因重组在一起，通过流感病毒的反向遗传操作系统救获一株在鸡胚和细胞均能产生很高的病毒滴度和血凝滴度的犬流感重组病毒，该重组病毒可作为研制犬流感疫苗的优良种毒。实施例1重组质粒的构建与鉴定1、PCR 扩增用Trizol (Invitrogen)抽提犬流感病毒 ZJCIV 的总 RNA。采用 Reverse Transcription System kit反转录试剂盒(TakaRa)，根据其说明书，用12bp引物 5，-AGCAAAAGCAGG-3，为特异性引物，合成cDNA第一链。以获得的cDNA的第一链为模板， 用 sap I -HA-up > sap I -HA-down 禾口 sapI-NA-up、sapI-NA_down 为上下游弓 I 物(含有 BspQI 酶切位点，如表1)，分别扩增出片段ZJCIV的HA和NA。PCR扩增程序为94°C预变性5min，进入以下循环，94°C变性45s，53°C退火45s，72°C延伸lmin45s，运行30个循环，最后再72°C 延伸lOmin。同时设无模板的阴性对照。反应结束后，PCR产物在1.0%琼脂糖凝胶上进行电泳实验。结果所图1所示，有两条PCR的条带出现，大小分别约为1700bp的HA和1400bp 的NA，目的片段大小相符。在图1 中，M =DNA 分子量标准；1 =ZJCIV HA PCR 产物；2 =ZJCIV NA PCR 产物。表IA型流感病毒HA和NA基因的通用引物引物名称引物序列sapI-HA-upCACACAgctcttctattAGCAAAAGCAGGGG(SEQ ID NO. 5)sapI—HA—downCACACAgctcttcggccAGTAGAAACAAGGGTGTTTT(SEQ ID NO. 6)sapI-NA-upCACACAgctcttctattAG本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种犬流感重组病毒，其特征在于，该重组病毒包含：ＺＪＣＩＶ犬流感病毒的ＨＡ和ＮＡ基因、以及ＰＲ８病毒的ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、Ｍ、ＮＰ和ＮＳ六个内部基因，所述犬流感病毒ＨＡ基因的核苷酸序列选自：（１）编码ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１所示氨基酸序列的核苷酸序列；（２）编码与ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１所示氨基酸序列具有９８％以上同源性的氨基酸序列的核苷酸序列；所述犬流感病毒ＮＡ基因的核苷酸序列选自：（１）编码ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．２所示氨基酸序列的核苷酸序列；（２）编码与ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．２所示氨基酸序列具有９８％以上同源性的氨基酸序列的核苷酸序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李泽君，滕巧泱，张旭，周洁文，
申请(专利权)人：中国农业科学院上海兽医研究所，
类型：发明
国别省市：31