本发明专利技术属于分子生物学领域，公开了一种来源于自吞噬基因beclin?1启动子区域的启动子及其用途。本发明专利技术还公开了含有所述启动子的表达载体以及宿主细胞。本发明专利技术还公开了利用所述的启动子高表达目的基因的方法。本发明专利技术的启动子具有广泛的活性，在不同类型的宿主细胞中均能够指导目的基因高水平表达。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学领域；更具体地，本专利技术涉及人自吞噬基因启动子，以及该启动子的应用。
技术介绍
自吞噬是一种广泛存在的生理机制，其主要是将细胞质中的大分子物质(如蛋白质、糖原等)和一些细胞内源性底物(包括由于生理或病理原因引起的衰老、破损的细胞器)在单位膜包裹的囊泡中大量降解，实现再循环，以维持细胞自身稳定的过程。自吞噬具有多种生理功能，例如①在养料缺乏时为细胞提供营养；②细胞分化；③细胞死亡及老化；④阻止癌症的发生。自吞噬还与多种疾病的病理过程有关，例如阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿舞蹈症和心力衰竭等。人自吞噬基因beclin 1是最早发现的哺乳动物中参与自吞噬的基因。研究表明该基因具有诱导自吞噬、抗病毒、抑制肿瘤生长和参与胚胎早期发育等多种重要生物功能。 然而，对于该基因的表达调控研究还很少。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种来源于自吞噬基因beclin 1启动子区域的启动子及其用途。本专利技术的另一目的在于提供含有所述启动子的表达载体以及宿主细胞。本专利技术的另一目的在于提供一种利用所述的启动子高表达目的基因的方法。在本专利技术的第一方面，提供一种分离的核酸(启动子)，所述核酸序列选自下组(1)具有SEQ ID NO 1中第(368士50)-(816士25)位所示序列的核酸序列；或(2)在严格条件下能够与⑴限定的核酸序列杂交且具有指导目的基因高水平表达功能的核酸序列；(3)与⑴限定的核酸序列有95%以上同源性且具有指导目的基因高水平表达功能的核酸序列。(4)与(1)_(3)任一限定的核酸序列互补(优选完全互补)的核酸序列。在另一优选例中，所述的“高水平表达”是指利用本专利技术的核酸(本专利技术的启动子)作为启动子元件指导一目的基因的表达与利用具有SEQ ID NO :1序列的启动子指导该目的基因表达相比，利用本专利技术的核酸所得的表达量高50 %，优选地表达量高100 %，更优选地表达量高200 %，进一步优选地表达量高300 %或更高。在另一优选例中，(1)项中，具有SEQ ID NO 1中第(368士20)-(831 士 10)位所示序列的核酸序列；优选的，具有SEQ ID NO 1中第(368士 10)-(836士5)位所示序列的核酸序列。更优选的，具有SEQ ID NO 1中第368-841位所示序列的核酸序列。在本专利技术的第二方面，提供一种载体，所述的载体含有所述的核酸，作为启动子元件。在另一优选例中，所述的载体是真核表达载体。在另一优选例中，所述的载体中不含有SEQ ID NO 1所示的核酸序列。在另一优选例中，所述的载体还含有与所述的核酸可操作地连接的目的基因。在另一优选例中，所述的目的基因是外源基因。在另一优选例中，所述的目的基因是结构基因。在另一优选例中，所述的目的基因序列位于所述核酸序列的下游，且是与所述的核酸序列直接邻近的编码基因的序列。通常，所述的核酸序列与目的基因序列的间隔小于 500bp (优选的，小于200bp ；更优选的，小于IOObp ；最优选的，小于50bp)。在另一优选例中，所述的目的基因包括(但不限于)自吞噬基因(beclin 1)、荧光素酶基因、绿色荧光蛋白。在本专利技术的第三方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，所述的细胞含有所述的载体；或其基因组中整合有外源的所述的核酸以及与该核酸可操作地连接的目的基因。在另一优选例中，所述的细胞选自(但不限于)大肠杆菌细胞、人永生化肝正常细胞L02、肝癌细胞H印G2、肝癌细胞BEL-7404、人胚胎肾细胞HEK-293T、或人乳腺癌细胞 MCF-7。在本专利技术的第四方面，提供所述的核酸的用途，用于作为启动子元件，指导目的基因的高表达。在本专利技术的第五方面，提供一种高表达目的基因的方法，所述的方法包括(a)在适合表达的条件下，培养所述的宿主细胞；和(b)从培养物中分离出目的蛋白(即由目的基因表达的蛋白)。本专利技术的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。附图说明图1显示不同长度的beclin 1启动子片段在L02细胞中的活力测定，鉴定出 beclin 1基因5，上游-277/+197区域具有最大活力，beclin 1基因5，上游-58/+197区域包含了最基本的启动子区域。图2显示不同长度的beclin 1启动子片段在BEL-7404 (A)和H印G2 (B)细胞中的活力测定，证明beclin 1启动子在肝癌细胞中具有活性，且beclin 1基因5’上游-277/+197区域具有最高的活性。图3显示不同长度的beclin 1启动子在HEK-293T细胞中的活力测定，证明 beclin 1启动子在人胚胎肾细胞中具有活性，且beclin 1基因5’上游-277/+197区域具有最高的活性。图4显示不同长度的beclin 1启动子在MCF7细胞中的活力测定，证明beclin 1 启动子在乳腺癌细胞中具有活性，且beclin 1基因5’上游-277/+197区域具有最高的活性。图5显示beclin 1启动子 序列以及其中潜在的转录因子结合位点。箭头表示转录起始位点。具体实施例方式本专利技术人通过广泛而深入的研究，意外地找到一种核酸，将其作为启动子元件，可指导目的基因高水平表达。本专利技术的启动子来源于自吞噬基因Beclinl的启动子区域。本专利技术的启动子具有广泛的活性，在不同类型的宿主细胞中均能够指导目的基因高水平表达，无细胞种类的特异性。在此基础上完成了本专利技术。如本文所用，所述的“启动子”或“启动子区(域)”是指一种核酸序列，其通常存在于目的基因编码序列的上游(5’端)，能够引导核酸序列转录为mRNA。一般地，启动子或启动子区提供RNA聚合酶和正确起始转录所必需的其它因子的识别位点。在本文中，所述的启动子或启动子区包括启动子的变体，其通过插入或删除调控区域，进行随机或定点突变等来获得。如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。如本文所用，所述的“可操作地连接”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“可操作地连接”到该核酸序列上。如本文所用，所述的“高水平表达”是指利用本专利技术的启动子指导一目的基因 (如荧光素酶基因)的表达与利用具有SEQ ID NO :1序列的启动子指导该目的基因表达相比，利用本专利技术的启动子所得的表达量高50%，优选地表达量高100%，更优选地表达量高200 %，进一步优选地表达量高300 %或更高。蛋白表达量的检测是本领域技术人员熟知的技术。启动子及其指导的基因表达本专利技术人在研究过程中，发现全长的人beclin 1基因的启动子(序列如图5所示)的活性不够高，并且意外地发现利用人beclin 1基因启动子序列第 (368士50)-(816士25)位(优选的是第(368士20)-(831 士 10)位，更优选的是第 368-841 位)区域构建的真核表达载体，可以高强度地启动外源基因的大量表达。因此，本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种分离的核酸，其特征在于，所述核酸序列选自下组：（１）如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１所示的核苷酸序列；或（２）如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１中第５８７－８４１位所示的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：赵慕钧，唐红，答亮，李栋，毛怡，李颖，徐振华，李载平，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：31
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