本发明专利技术涉及双chU6启动子双shRNA表达质粒的构建及应用，属于生物制药领域。构建鸡U6启动子（chU6），设计两个靶向分别针对IBDVVP1和VP2基因的小发夹RNA（shRNA）：VP1-shRNA2550和VP2-shRNA392。构建表达质粒pSilencer2.1+2chU6+VP1VP2shRNA，转染鸡胚成纤维细胞（CEF），接种IBDV，可抑制病毒复制。将表达质粒pSilencer2.1+2chU6+VP1VP2shRNA与IBDV混合，接种于10日龄SPF鸡胚尿囊腔，可保护鸡胚免受IBDV感染。本发明专利技术构建的双chU6启动子双shRNA表达质粒是一种新型IBDV防治制剂，具有良好的实用价值和推广前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及双chU6启动子双ShRNA表达质粒pSilencer2. l+2chU6+VPlVP2shRNA的构建及应用，属于生物制药领域。
技术介绍
传染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease, IBD)是一种高度危害养鸡业的传染病，它是由传染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus, IBDV)引起，以侵害雏鸡淋巴组织，特别是中枢免疫器官一法氏囊为主要特征，被称为世界三大禽病之一。IBDV 感染后，会引起鸡的免疫抑制，使鸡的免疫能力下降、疫苗免疫失败、导致易感其它疾病。长期以来，对IBDV采取了免疫预防为主的综合性防控措施，该病的大规模流行已得到有效控制，但由于近期各地变异株和超强毒株(vvIBDV)的出现使该病的防控难度加大，IBD免疫预防失败已成为各区域禽病防控中的重要问题。目前，使用的常规弱毒疫苗和灭活疫苗，其安全性和制造工艺仍存在不足为预防变异毒株而采用中强毒力活疫苗存在着较大的生物安全问题，因为在不同IBDV毒株之间潜在着基因重配的可能，给该病的防控带来隐患；灭活疫苗存在着抗原制备的困难；以VP2 为靶基因的IBD基因工程疫苗，采用的表达系统包括大肠杆菌、酵母、鸡痘病毒载体、杆状病毒表达载体、核酸疫苗以及多表位疫苗等，各有所长，仍需改进。因此，探索新的IBDV防控技术是十分必要的。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA (double-stranded RNA, dsRNA)诱发的同源mRNA高效特异性降解的现象。当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默。RNAi现象自发现以来，其研究领域从基因功能扩展到抗肿瘤和抗病毒，RNAi被认为是机体阻止外来病毒感染、保护细胞免受病毒入侵的一种细胞自我保护机制，以病毒基因和宿主细胞分子为靶点，引入外源的小干扰RNA (short interfering RNA，siRNA)或小发夹RNA (short hairpin RNA, shRNA)能显著抑制病毒的表达。RNAi作为一种抗病毒感染的新途径已成功地应用于多种病毒，显示出了良好的应用前景。IBDV属双RNA病毒科双RNA病毒属，基因组包括大(A)小(B)两个片段。VPl是病毒的非结构蛋白，是由B片段编码的一种依赖RNA的RNA聚合酶(RdRp)，VPl与病毒RNA 的复制和毒力有关。VP2是病毒的主要结构蛋白之一，由A片段编码的多聚蛋白加工而成， 位于病毒粒子的外表面，占总结构蛋白量的51%，既是病毒的主要结构蛋白，又是病毒的主要保护性抗原，与病毒中和抗体的诱导、抗原和毒力的变异以及细胞凋亡的诱导等有关。因此，选择IBDV VPl和IBDV VP2基因为靶标，构建了一个同时靶向IBDV VPl和VP2基因的双 chU6启动子双shRNA表达质粒pSilencer2. l+2chU6+VPlVP2shRNA,既可以保证两个shRNA 被同时高效转录，不受转录位置先后的影响；又可以同时敲除IBDV的两个重要基因，高效抑制的IBDV复制，是一种新型IBDV防治制剂，具有良好的实用价值和推广前景。三、
技术实现思路
技术问题目前，使用的IBDV常规弱毒疫苗和灭活疫苗，其安全性和制造工艺仍存在不足为预防变异毒株而采用中强毒力活疫苗存在着较大的生物安全问题，因为在不同IBDV毒株之间潜在着基因重配的可能，给该病的防控带来隐患；灭活疫苗存在着抗原制备的困难；以 VP2为靶基因的IBD基因工程疫苗，采用的表达系统包括大肠杆菌、酵母、鸡痘病毒载体、 杆状病毒表达载体、核酸疫苗以及多表位疫苗等，各有所长，仍需改进。SiRNA因其合成价格昂贵、稳定性差、毒性大，而使其使用受到限制；shRNA表达载体则克服了上述缺点，它具有稳定性好、毒性小，在细胞中持续抑制靶基因的表达可持续数星期甚至更久。但是，目前shRNA表达载体使用的RNA聚合酶III启动子 (pol III)主要为人源和鼠源的TO启动子和人Hl启动子，它们在禽源细胞中的转录活性并不理想，且目前市场上尚无禽源细胞特异性RNA聚合酶III启动子，因此开发高效的禽源细胞特异性shRNA启动子具有重要意义。本专利技术选择IBDV VPl和IBDV VP2基因为靶标，构建一个同时靶向IBDV VPl和VP2基因的双chTO启动子双shRNA表达质粒 pSilencer2. l+2chU6+VPlVP2shRNA,既可以保证两个shRNA被同时高效转录，又可以同时敲除IBDV的两个重要基因，高效抑制IBDV的复制，在IBDV新型防治制剂方面具有良好的应用前景。技术方案运用基因工程方法构建鸡TO启动子(chU6 )；设计两个靶向分别为IBDV VP1和VP2基因的 shRNA 分子；构建双 chU6 启动子双 shRNA 表达质粒 pSilencer2. l+2chU6+VPlVP2shRNA ； 应用表达质粒pSilencer2. l+2chU6+VPlVP2shRNA在CEF细胞和SPF鸡胚上进行功能分析。 具体包括1、鸡冊启动子(0仙6)的构建根据参考文献设计引物，上游引物引入EcoR I.Sal I位点，下游引物引入Hind III、 XhoI、BamH I位点，引物由Invitrogen公司合成chU6 (F) 5- CG GAATTC kCGCGTCGAC GCGGCCGCGACAACACAAGCATCGAG-3chU6(R) ^-CCCAAGCTTCCQCTCGAGCQGGA 7TCTAGTATATGTGCTGCCGAAGCGAGCACGGAC-3取新鲜的鸡肝脏组织(IOOmg)充分剪碎，按TIANDZ公司的柱式动物DNAout说明书提取基因组DNA。以鸡的基因组DNA为模板，按下面50μ PCR反应体系扩增chTO启动子鸡基因组 DNA IOOng, IOXPCR Reaction Buffer 5μ ,25 mmol. T1MgCl2 4μ ,2. 5mmol. L-1 dNTP mix 4μ , lOpmol. L-1 chU6 (F) Ιμ , lOpmol. L-1 chU6 (R) lPL，Taq DNA polymerase 5U, ddH20 32μ 。PCR 扩增条件94°C 3min，94°C 45s, 62 °C 45s, 72 °C 45s，32 个循环；72 °C IOmin0 PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，DNA胶回收试剂盒纯化，T4 DNA Ligase连接，转化 E. coli T0P10感受态细菌，涂布在用LB配制的1. 5%琼脂平皿上(含lOOPg/ml氨苄青霉素、100 μδ/πι1 X-gal和40 μδ/πι1 IPTG)，37°C培养14 h。挑单菌落接种入LB (含氨苄青霉素10(^g/ml)，振摇培养12 h，用MiniBEST质粒纯化试剂盒提取质粒，AcoR I和历'/ d III双酶切鉴定，获得含有chTO序列的重组质粒pMD18-chU6。测序分析。构建的ChTO启动子其特征具有RNA聚合酶III的三个上游元件0CT、PSE本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种双ｃｈＵ６启动子双ｓｈＲＮＡ表达质粒，其构建方法为：１）鸡Ｕ６启动子ｃｈＵ６的构建设计引物，上游引物引入ＥｃｏＲ Ｉ、Ｓａｌ Ｉ位点，下游引物引入Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、ＸｈｏＩ、ＢａｍＨ Ｉ位点：ｃｈＵ６（Ｆ）：５－ ＣＧ ＧＡＡＴＴＣＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣ ＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＣＡＡＣＡＣＡＡＧＣＡＴＣＧＡＧ－３ｃｈＵ６（Ｒ）：５－ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＧＡＴＣＣＴＡＧＴＡＴＡＴＧＴＧＣＴＧＣＣＧＡＡＧＣＧＡＧＣＡＣＧＧＡＣ－３ 以鸡的基因组ＤＮＡ为模板，按下面５０μＬ ＰＣＲ反应体系扩增ｃｈＵ６启动子：鸡基因组ＤＮＡ １００ｎｇ，１０×ＰＣＲ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ，２５ ｍｍｏｌ．Ｌ－１ＭｇＣｌ２ ４μＬ，２．５ｍｍｏｌ．Ｌ－１ ｄＮＴＰ ｍｉｘ ４μＬ，１０ｐｍｏｌ．Ｌ－１ ｃｈＵ６（Ｆ） １μＬ，１０ｐｍｏｌ．Ｌ－１ ｃｈＵ６（Ｒ） １μＬ，Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ５Ｕ，ｄｄＨ２Ｏ ３２μＬ；ＰＣＲ扩增条件：９４℃ ３ｍｉｎ，９４℃ ４５ｓ，６２℃ ４５ｓ，７２℃ ４５ｓ，３２个循环；７２℃ １０ｍｉｎ；ＰＣＲ产物经１％琼脂糖凝胶电泳，ＤＮＡ胶回收试剂盒纯化，Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ连接，转化Ｅ． ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０感受态细菌，纯化，ＥｃｏＲⅠ和Ｈｉｎｄ Ⅲ双酶切鉴定，获得含有ｃｈＵ６序列的重组质粒ｐＭＤ１８－ｃｈＵ６，构建的ｃｈＵ６启动子具有ＲＮＡ聚合酶Ⅲ的三个上游元件：ＯＣＴ、ＰＳＥ、ＴＡＴＡ；２）两个靶向分别为ＩＢＤＶ ＶＰ１和ＶＰ２基因的ｓｈＲＮＡ分子设计ｓｈＲＮＡ名称编码ｓｈＲＮＡ的ＤＮＡ序列ＶＰ１－ｓｈＲＮＡ２５５０（Ｆ）５－ＧＡＴＣＣＣＣＧＴＡＣＣＣＡＧＡＡＧＴＣＡＡＧＡＡＣＴＴＣＡＡＧＡＧＡＧＴＴＣＴＴＧＡＣＴＴＣＴＧＧＧＴＡＣＴＴＴＴＴＣ－３ＶＰ１－ｓｈＲＮＡ２５５０（Ｒ）５－ＴＣＧＡＧＡＡＡＡＡＧＴＡＣＣＣＡＧＡＡＧＴＣＡＡＧＡＡＣＴＣＴＣＴＴＧＡＡＧＴＴＣＴＴＧＡＣＴＴＣＴＧＧＧＴＡＣＧＧＧ－３ＶＰ２－ｓｈＲＮＡ３９２（Ｆ）５－ＧＡＴＣＣＣＣＧＡＡＧＣＣＴＧＡＧＴＧＡＡＣＴＧＡＣＴＴＣＡＡＧＡＧＡＧＴＣＡＧＴＴＣＡＣＴＣＡＧＧＣＴＴＣＴＴＴＴＴＣ－３ＶＰ２－ｓｈＲＮＡ３９２（Ｒ）５－ＴＣＧＡＧＡＡＡＡＡＧＡＡＧＣＣＴＧＡＧＴＧＡＡＣＴＧＡＣＴＣＴＣＴＴＧＡＡＧＴＣＡＧＴＴＣＡＣＴＣＡＧＧＣＴＴＣＧＧＧ－３将合成的编码ＶＰ１－ｓｈＲＮＡ２５５０、ＶＰ２－ｓｈＲＮＡ３９２的单链ＤＮＡ序列分别按照Ｆ与Ｒ的方法配对退火，分别得到双链ｓｈＲＮＡ，反应体系为：１００ ｐｍｏｌ／μＬ的正义ＤＮＡ模板１０ μＬ，１００ ｐｍｏｌ／μＬ的反义ＤＮＡ模板１０ μＬ，５×Ａｎｎｅａｌｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ ｆｏｒ ＤＮＡ Ｏｌｉｇｏｓ ２０ μＬ，Ｎｕｃｌｅａｓｅ－Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒ ６０ μＬ，９５℃ ５ ｍｉｎ，室温退火３０ ｍｉｎ，制备双链ｓｈＲＮＡ；３）双ｃｈＵ６启动子双ｓｈＲＮＡ表达质粒ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ２．１＋２ｃｈＵ６＋ＶＰ１ＶＰ２ｓｈＲＮＡ的构建将制备的ＶＰ１－ｓｈＲＮＡ２５５０、ＶＰ２－ｓｈＲＮＡ３９２分别插入ｐＭＤ１８－ｃｈＵ６的ＢａｍＨⅠ与ＸｈｏⅠ位点，获得重组质粒ｐＭＤ１８－ｃｈＵ６＋ＶＰ１－ｓｈＲＮＡ２５５０和ｐＭＤ１８－ｃｈＵ６＋ ＶＰ２－ｓｈＲＮＡ３９２；将ｐＭＤ１８－ｃｈＵ６＋ ＶＰ２－ｓｈＲＮＡ３９２质粒用ＸｈｏⅠ单酶切，１％琼脂糖凝胶电泳、ＤＮＡ凝胶回收试剂盒回收ｐＭＤ１８－ｃｈＵ６＋ＶＰ２－ｓｈＲＮＡ３９２片段；将ｐＭＤ１８－ｃｈＵ６＋ＶＰ１－ｓｈＲＮＡ２５５０质粒用ＳａｌＩ与ＸｈｏⅠ双酶切，１％琼脂糖凝胶电泳、ＤＮＡ凝胶回收试剂盒回收ｃｈＵ６＋ＶＰ１－ｓｈＲＮＡ２５５０片段；Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ连接，转化Ｅ． ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０感受态细菌，纯化，ＢａｍＨ Ｉ单酶切鉴定，获得重组质粒ｐＭＤ１８＋２ｃｈＵ６＋ＶＰ１ＶＰ２ｓｈＲＮＡ；将质粒ｐＭＤ１８＋２ｃｈＵ６＋ＶＰ１ＶＰ２ｓｈＲＮＡ和质粒ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ ２．１－Ｕ６ ｎｅｏ分别用ＥｃｏＲⅠ和Ｈｉｎｄ Ⅲ双酶切，用１％的琼脂糖凝胶电泳回收２ｃｈＵ６＋ＶＰ１ＶＰ２ｓｈＲＮＡ片段和ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ ２．１－Ｕ６ ｎｅｏ载体片段，ＤＮＡ凝胶回收试剂盒纯化，Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ连接，转化Ｅ． ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０感受态细菌，纯化，ＥｃｏＲⅠ和Ｈｉｎｄ Ⅲ双酶切鉴定，获得表达质粒ｐ Ｓｉｌｅｎｃｅｒ ２．１＋２ｃｈＵ６＋ＶＰ１ＶＰ２ｓｈＲＮＡ。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：欧阳伟，王永山，马金荣，张海彬，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：84
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