本发明专利技术公开了一株阴沟肠杆菌溶解亚种(Enterobacter?cloacae?subsp.dissolvens?SDM)及其在制备2，3-丁二醇中的应用。该阴沟肠杆菌溶解亚种保藏号为CGMCC?No.4230。本发明专利技术的菌株能够利用五碳糖、六碳糖、糖蜜、淀粉类原料水解液、木质纤维素原料水解液，具有转化率高，产物浓度高，底物谱广等优点。本发明专利技术所述操作方法简单，成本较低，效率高，发酵罐补料分批发酵2，3-丁二醇产量可达到125～162g/L，转化率达到理论转化率的90～95％，2，3-丁二醇最大生产率为4.1g/(L·h)，极具工业化推广应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一株阴沟肠杆菌溶解亚种及其应用，尤其涉及一株高产2，3_ 丁二醇的阴沟肠杆菌溶解亚种及其在制备2，3_ 丁二醇中的应用，属于生物工程
技术介绍
2，3-丁二醇0，3-butanediol)是一种潜在的非常有价值的平台化合物，广泛用于医药、化工、食品、燃料以及航空航天等多个领域(CeliAska, E.，Grajek, W.，2009. Biotechnol. Adv. 27，715-725.)。左旋形式的2，3-丁二醇由于其具有较低的凝固点可以作为抗冻剂。2，3_丁二醇可以作为前体物质用于生产在化工领域具有极其广泛用途的甲乙酮和1，3- 丁二烯。2，3- 丁二醇的燃烧值为27200kJ/kg，同乙醇相当Q9055kJ/kg)，是一种潜在价值很高的燃料添加剂。2，3- 丁二醇还可用来制备聚合物、油墨、香水、熏蒸剂、增湿剂、 软化剂、增塑剂、炸药以及药物的手性载体等等。2，3-丁二醇如此广泛的用途导致其在国际市场上的需求不断上涨，作为液体燃料添加剂的研究也引起了世界的广泛关注。2，3- 丁二醇的生产主要是微生物发酵法，与化学合成法相比，该方法环境友好，工艺简单，技术上较为成熟，符合绿色化工的要求。细菌是对发酵生产2，3-丁二醇有工业价值的微生物。用于发酵生产2，3-丁二醇的细菌菌属主要有克雷伯氏菌属(Klebsiella)、 沙雷氏菌属Gerratia)、芽孢杆菌属(Bacillus)和气单胞菌属(Aeromonas)等。关于肠杆菌属(Enterobacter)生产2，3-丁二醇的报道较少，其2，3-丁二醇的产量均较低(中国专利 CN101709281A, CN101709280A ；Saha, B. C.，Bothast, R. J.，1999. Appl. Microbiol. Biotechnol. 52，321-326，赵世敏等，2008 年.食品与发酵工业.34 (3)，25-28)。经检索，目前未见有使用阴沟肠杆菌溶解亚种发酵生产2，3_丁二醇的专利报道。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术要解决的问题是提供一株高产2，3_ 丁二醇的阴沟肠杆菌溶解亚种(Enterobacter cloacae subsp. dissolvens)，及其所述菌在制备2，3_ 丁二醇中的应用。本专利技术所述产2，3_ 丁二醇的阴沟肠杆菌溶解亚种，其特征在于该菌株名为阴沟肠杆菌溶角军亚种(Enterobacter cloacae subsp. dissolvens) SDM，菌株已于 2010 年 10 月 19日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC No. 4230。上述阴沟肠杆菌溶解亚种(Enterobacter cloacae subsp. dissolvens)菌株SDM是从山东济南郊区的农田土壤中筛选得到。经德国Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(简称 DSMZ)鉴定，其生物学特征是革兰氏阴性，兼性厌氧，具有运动性的棒杆菌，长1. 2 2. 5 μ m，宽0. 7 0. 8 μ m。 VP反应，ONPG反应，过氧化氢酶，尿酶，精氨酸双水解酶，鸟氨酸脱羧酶呈阳性。甲基红反应，氧化酶反应，明胶水解反应和吲哚产生反应呈阴性。其菌落颜色为黄白色，圆形、凸起、有光泽、表面光滑、直径2 3mm。它可利用葡萄糖、果糖、甘露糖、麦芽糖、D-木糖、蔗糖、海藻糖、L-阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖、柠檬酸盐和丙二酸盐，37°C发酵葡萄糖产酸产气。能在 KCN上生长。其16S rDNA序列如SEQ ID No. 1所示，序列长度为1504bp，所述序列与多株阴沟肠杆菌溶解亚种的16S rDNA序列比对相似性达到99. 9%。本专利技术所述由阴沟肠杆菌溶解亚种(Enterobacter cloacae subsp. dissolvens) SDMCGMCC No. 4230发酵生产2，3- 丁二醇的方法，其涉及的步骤是(1)菌种选择。选阴沟肠杆菌溶解亚种(Enterobacter cloacae subsp. dissolvens) SDM CGMCC No. 4230。( 斜面培养活化将阴沟肠杆菌溶解亚种(Enterobacter cloacae subsp. dissolvens) SDM CGMCC No. 4230菌种接种于斜面培养基，30 40°C条件下，静置培养10 14小时，备用；(3)摇瓶发酵种子培养将步骤( 培养的斜面菌株，在无菌条件下用接种环接 1 2环于40 60mL液体种子培养基的300mL三角瓶中，置于转速为150 200rpm的摇床上，30 40°C培养10 16小时，得到种子培养液；(4)发酵罐发酵种子培养一级种子培养将步骤( 培养的斜面菌株，在无菌条件下用接种环接1 2环于 80 120mL液体种子培养基的500mL三角瓶中，置于转速为150 200rpm的摇床上，30 40°C培养10 16小时，得到一级种子培养液；扩大培养将上述培养的一级种子，在无菌条件下以5 10% (体积比)的接种量接种于0. 8 1. 2升液体种子培养基的5升三角瓶中，置于转速为150 200rpm的摇床上，30 40°C培养10 16小时，得到二级种子培养液；(5)发酵培养摇瓶发酵以5 10% (体积比)的接种量，将种子液接种于装有80 120mL发酵培养基的500mL三角瓶瓶中，置于转速为150 200rpm的摇床上，30 40°C培养16 30小时，当发酵液中2，3- 丁二醇浓度不再上升时，发酵停止。50升发酵罐发酵以体积比5 10%的接种量，将二级种子液接种于50升发酵罐中，发酵罐装液量为30升，然后以初始碳源浓度为60 120g/L、温度30 40°C、搅拌转速 200 600rpm、通气量0. 5 1. 5vvm进行通风搅拌发酵培养，培养时间为20 60小时；发酵液初始PH值调至5. 5 7. 0，发酵过程中，通过流加3 6M的KOH和2 5M的H3PO4来调节PH值，使之控制在pH5. 5 6. 5 ；发酵过程中，每隔3 5小时取样测定发酵液中的残糖量和2，3- 丁二醇浓度，并依据残糖浓度流加碳源，当2，3- 丁二醇浓度不再上升时，发酵结束。上述斜面培养基组成为葡萄糖15g/L，蛋白胨4g/L，酵母膏4g/L，氯化钠2g/L， 氯化钾2g/L，硫酸镁1. 5g/L，琼脂粉18g/L，pH值调至5. 5 7. 0，蒸馏水配制，115°C灭菌 20分钟；上述种子培养基组成为碳源30 40g/L，磷酸二氢钾3 10g/L，氯化铵3 12g/L，氯化钠1 4g/L，硫酸镁0. 05 0. lg/L，硫酸亚铁0. 05 0. lg/L，pH值调至5. 5 7. 0，蒸馏水配制，115°C灭菌20分钟；上述发酵培养基组成为碳源60 120g/L，玉米浆干粉5 20g/L，磷酸二氢钾 3 10g/L，氯化铵5 25g/L，乙酸钾1 4g/L，氯化钠1 4g/L，氯化钙0. 05 0. Ig/ 本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一株产２，３－丁二醇的阴沟肠杆菌溶解亚种，其特征在于：该菌株名为阴沟肠杆菌溶解亚种（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ ｓｕｂｓｐ．ｄｉｓｓｏｌｖｅｎｓ）ＳＤＭ，菌株已于２０１０年１０月１９日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．４２３０。
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：马翠卿，许平，王爱龙，李理想，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：88
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