本发明专利技术涉及一种STEMPRO?MSC?SFM无血清Cytoline1微载体培养技术，培养人脐带间充质干细胞(HUMSC)表达重组人2.5SβNGF和分离纯化人2.5SβNGF的新方法。该方法采HUMSC表达系统表达2.5S-βNGF，采用等电点沉淀、CM-SepharosFF和SP-SepharoeHP层析三步联用法分离纯化。该方法与从小鼠颌下腺提取NGF或大肠杆菌表达系统表达NGF利用亲和层析、离子交换层析和疏水层析技术分离相比，具有生产规模大、产品纯度高、产品生物活性高和收率高、可避免异源性蛋白的污染等优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术是涉及生物医药
，特别是一种用人脐带间充质干细胞(HUMSC)表达人2. 5S β -神经生长因子(2. 5S β -NGF)及分离纯化的方法。
技术介绍
神经生长因子(NGF)是神经营养因子中最早被发现，目前研究最为透彻的，具有神经元营养和促突起生长双重生物学功能的一种神经细胞生长调节因子，它对中枢及周围神经元的发育、分化、生长、再生和功能特性的表达均具有重要的调控作用。NGF包含α、 β、Y三个亚单位，活性区是β亚单位，由两个118个氨基酸组成的单链通过非共价键结合而成的二聚体。NGF在人体内主要分布于脑、神经节、虹膜、心脏、脾、胎盘等组织及成纤维细胞、平滑肌、骨骼肌、胶质细胞、雪旺氏细胞等。NGF与受体结合，通过受体介导的内吞机制产生内在化，形成由轴膜包绕、含有NGF、并保持其生物活性的小泡，经轴突沿微管逆行转运至胞体，经酪氨酸蛋白激酶、脂酰肌醇钙、内源性环腺苷酸等第二信使体系的转导，启动一系列级联反应，对靶细胞的某些结构或功能蛋白基因表达进行调控而发挥其生物效应。大鼠体内试验结果表明神经生长因子可改善由己二酮和丙烯酰胺造成的大鼠中毒性周围神经病所致的肢体运动功能障碍，缩短神经_肌肉动作电位潜伏期，并提高神经-肌肉动作电位幅度。组织病理学检查结果表明，神经生长因子有减轻动物胫神经的髓鞘肿胀发生率和降低变性胫神经纤维数量等作用。以上结果提示神经生长因子可能有促进神经损伤修复的作用。目前，生产2. 5Si3-NGF的方法主要从小鼠颂下腺提取，还没见到利用HUMSC表达的报道。利用HUMSC细胞表达2. 5S β -NGF是新一代NGF表达系统，它克服了传统大肠杆菌系统不能进行翻译后的修饰活性低等缺点。利用基因重组技术表达人神经生长因子的优点是NGF的结构和功能与人体天然的NGF结构和功能完全一致，没有免疫原性，具有半衰期较长，没有鼠源性病毒交叉感染的安全隐患等优点。在临床上治疗神经损伤，促进损伤神经恢复方面占有重要地位。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用HUMSC干细胞表达重组人2. 5S β NGF，采用等电点沉淀、CM-SepharosFF和SP-S^haroeHP层析三步联用法分离纯化法。人体脐带间充质干细胞表达人体2. 5S β -神经生长因子及分离纯化的方法，包括如下步骤1、HUMSC原代细胞的分离与培养；2、传代扩增；3、冻存4,2. 5S β -NGF克隆、诱导分化与扩增；35、HUMSC的微载体扩增；6、2. 5S β -NGF 的分离纯化。该方法的有益效果是具有比传统亲和层析、离子交换层析和疏水层析法具有分离规模大、产品纯度高、活性高和收率高等优点。具体实施例方式实施例1一、HUMSC原代细胞的分离与培养1、取破宫产无菌脐带20cm，置无菌生理盐水瓶中，4°C保存。2、生物安全柜中清洗脐带血渍，将脐带剪成5cm片段，剔除血管，PBS洗涤2次。3、将8cm长的脐带转移到IOcm的培养皿中，加入青霉素和链霉素，浓度分别为100 单位/ml和100微克/ml。4、将脐带剪成IOmm3小块，加入10% I型胶原酶和透明质酸酶消化，工作浓度为 0. 1% (含3mM的CaCl2,)，混勻，37°C消化4小时。5,STEMPRO MSC SFM培养消化液用200目过滤，细胞悬液300G离心5分钟，收集细胞，接种于25T细胞瓶培养，温度37°C，饱和湿度，5% C02。6、3天后换液，除去未贴壁细胞，继续用STEMPRO MSC SFM培养。二、传代扩增1、原代细胞培养12天后，培养瓶内细胞达到80 %生长面积，集落生长达到95 %融合可进行传代，Pl代后90%融合后可传代。2、弃培养基，PBS洗3次，0. 5%胰蛋白酶-EDTA消化40秒。3、STEMPRO MSC SFM中和胰蛋白酶，离心收获细胞，STEMPRO MSCSFM分瓶培养传代。三、冻存1、取对数生长期的HUMSC加10% DMSO和FBS于冻存管按冻存曲线在程控降温仪中降温，降温结束后置液氮中保存。四、2. 5S β -NGF克隆、诱导分化与扩增1、将带有(1)2. 5S β-NGF 基因、(beta 亚基)；(2) EGFP (enhanced green fluorescent protein)基因和(3) Neo (R)基因(新霉素抗性基因)的慢病毒载体 LV(multigenic lentivira lvector,LV)导入HUMSC干细胞培养基培养，经筛选、鉴定后再诱导分化。在二甲基亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)和细胞因子等诱导下，HUMSC可向神经细胞和神经胶质细胞分化。将HUMSCs在STEMPROMSC SFM培养基培养，加入神经条件培养基NCM中诱导成神经细胞，进一步诱导，最后可得到12. 7%的酪氨酸羟化酶TH阳性神经细胞，该细胞能分泌出多巴胺。并表达成熟神经细胞相关蛋白、可稳定的表达2. 5S β -NGF,生物活性可达到180万AU/mgNGF，还可分泌如粒细胞集落刺激因子(G-SCF)、胶质细胞源性神经营养因子(⑶NF)和脑源性神经营养因子(BDNF)等各种神经营养因子。五、HUMSC的Cytoline 1微载体培养1、小规模一次性生物反应器Cytoline 1微载体培养将诱导分化的细胞和微体进行小规模培养，Cytoline 1微载体浓度为5克/L，待细胞浓度达到2 X IO6后转入大规模培养。2、大规模一次性生物反应器微载体培养将小规模培养的细胞换液，调整细胞密度至5X 105cellS/ml，加入间充质干细胞培养基和微载体，加入组合细胞因子SCF 15ng/ ml, FL 5ng/ml, TPO 6ng/ml]，IL-3 15ng/l 1]，G-CSFlng/mg GM-CSF 5ng/ml，接种至生物反应器中，37°C、5% CO2,20% O2、饱和湿度条件下共同养12天；规模为每批5L，收获细胞总数约为5 X IO13个细胞。六、2. 5S β -NGF的分离纯化1、等电点沉淀；采用离心法将培养基和细胞分离，将培养基Ph调至9. 1，搅勻，室温静置2小时，离心分离沉淀，备用。2、CM-SepharosFF 和 SP-S印haroeHP 层析分离CM-S印harosFF用2_3倍柱床体积的PH6. 8,0. 02MPB平衡，离心分离沉淀液经透析平衡后加入层析柱，流速50ml/h. cm2, s收集流出液，4°C酸化处理。再经SP-S印haroeHP层析，温度4°C，离子交换层析分离纯化2. 5Si3NGF，一次可分离IOL以上，可获得1 OmgNGF，生物活性达到150万AU/mg，分子量14，OOODa，等电点为9. 1。生物活性鉴定表明纯化后每毫克蛋NGF的比活性是原核表达的100多倍。该方法分离纯化的2. 5S β-NGF能促进鸡胚和新生小鼠背根节细胞在体外的存活、生长和分化。实施例2一、HUMSC原代细胞的分离与培养1、取破宫产无菌脐带30cm，置无菌生理盐水瓶中，5°C保存。生物安全柜中清洗脐带血渍，将脐带剪成6cm片段，剔除血管，PBS洗涤3次。2、将IOcm长的脐带转移到IOcm的培养皿中，加入青霉素和链霉素，浓度分别为 100本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．人脐带间充质干细胞表达人２．５Ｓβ－神经生长因子及分离纯化的方法，包括如下步骤：１）、ＨＵＭＳＣ原代细胞的分离与培养；２）、ＳＴＥＭＰＲＯ ＭＳＣ ＳＦＭ无血清Ｃｙｔｏｌｉｎｅ １微载体培养技术传代培养；３）、细胞冻存；４）、２．５Ｓβ－ＮＧＦ克隆、诱导分化与扩增；５）、ＨＵＭＳＣ的Ｃｙｔｏｌｉｎｅ １微载体扩增；７）、２．５Ｓβ－ＮＧＦ的分离纯化。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨国成，夏腊菊，周波，杨媛，
申请(专利权)人：武汉北度生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：83
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