本发明专利技术公开了一种球虫细胞培养模型，所述球虫细胞培养模型是通过将柔嫩艾美耳球虫子孢子接种入鸡胚成纤维细胞系DF-1细胞，并使其在DF-1细胞中发育至第一代裂殖子而建成。本发明专利技术还公开了上述球虫细胞培养模型在筛选抗球虫药物中的应用。本发明专利技术球虫细胞培养模型，可用于建立客观衡量子孢子入侵活力的检测方法，不仅适用于抗球虫药物的筛选，而且适用于对球虫发育过程中的基因或蛋白功能的研究。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及细胞培养模型，尤其涉及一种球虫细胞培养模型及其应用。
技术介绍
鸡球虫病是由艾美耳球虫寄生于鸡肠道上皮细胞引起的一种原虫病，广泛分布于世界各地，是目前危害养鸡业的重要疾病之一。其生活史较为复杂，需经历孢子生殖、裂殖生殖、配子生殖等发育阶段。细胞培养能为球虫研究提供洁净无污染的环境，同时使人们渴望在“无控”和“透明”环境下研究抗球虫药物的作用机制、活性以及球虫的发育、行为、 结构、免疫、遗传、细胞化学和生物化学等的梦想成为现实。球虫的传代细胞培养是球虫在体外合适的传代细胞体系中进行发育的过程，目前多集中于柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)培养方面，子孢子入侵细胞后只能发育为第1代裂殖子或第2代裂殖体阶段，但这并不妨碍传代细胞培养模型在鸡球虫研究领域中的应用。子孢子入侵宿主细胞进行裂殖生殖是球虫感染的关键，是理想的抗球虫药物作用的最佳阶段。此外，球虫的传代细胞培养模型还可以直观呈现虫体(子孢子)入侵宿主细胞后发育的动态变化过程，成为基因或蛋白功能研究有效的展示平台，被广泛用于基因和蛋白功能的研究。但是，目前缺乏高效、应用广泛的球虫细胞培养模型。鸡胚成纤维细胞系(ChickenEmbryo Fibroblast Cell line, DF-1)是一种稳定的传代细胞系，来源于East Lansing Line (ELL-O)鸡胚成纤维细胞，主要用于病毒研究领域，如病毒疫苗生产，重组病毒或蛋白的表达载体。到目前为止，还没有出现将该DF-I细胞培养体系应用于球虫细胞培养并建立球虫细胞培养模型的公开报道。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种球虫细胞培养模型，该细胞培养模型是首次将DF-I细胞培养体系用于球虫细胞培养而建立的球虫细胞培养模型，其应用广泛、效果好。此外，还需要提供一种上述球虫细胞培养模型的应用。为了解决上述技术问题，本专利技术通过如下技术方案实现在本专利技术的一个方面，提供了一种球虫细胞培养模型，所述球虫细胞培养模型是通过将柔嫩艾美耳球虫子孢子接种入鸡胚成纤维细胞系DF-I细胞，并使其在DF-I细胞中发育至第一代裂殖子而建成。在本专利技术的另一方面，提供了一种球虫细胞培养方法，包括以下步骤将柔嫩艾美耳球虫子孢子接种入DF-I细胞，并使其在DF-I细胞中发育至第一代裂殖子。优选的，所述DF-I细胞在接入子孢子之前，该DF-I细胞以1 50万个细胞/孔的细胞铺板剂量铺被微孔板。更优选的，所述DF-I细胞在接入子孢子之前，以10万个细胞 /孔的细胞铺板剂量铺被微孔板。因为随着DF-I细胞铺板剂量增大，子孢子的入侵率有所降低，结合流式细胞仪检测所需细胞数量考虑，确定最佳铺板剂量为10万个细胞/孔。优选的，所述柔嫩艾美耳球虫子孢子的接种剂量为1 50万个/孔。更优选的， 所述柔嫩艾美耳球虫子孢子的接种剂量为30万个/孔。随着子孢子的接种剂量增大，子孢子的入侵率逐渐增大，但当子孢子接种剂量为30万/孔时，子孢子入侵率的增加趋势平缓， 因此确定子孢子的最佳接种剂量为30万个/孔。优选的，所述DF-I细胞在接入子孢子之后，细胞培养基中添加浓度小于等于5% 的血清。当培养基中血清浓度为5%时，子孢子的入侵率最高，但随着血清浓度的增大，子孢子的入侵率逐渐降低，因此确定子孢子接种后培养基中的血清添加浓度不应大于5%。在本专利技术的另一方面，还提供了一种球虫子孢子入侵活力的检测方法，包括以下步骤用荧光探针标记柔嫩艾美耳球虫子孢子；将荧光标记的子孢子接种入DF-I细胞培养；用流式细胞仪检测球虫子孢子的入侵细胞数，并用下述公式计算出子孢子的入侵率，子孢子的入侵率=100% X 。优选的，在荧光标记的子孢子接种入DF-I细胞后8 12小时，用流式细胞仪检测该球虫子孢子的入侵细胞数。子孢子在接种DF-I细胞后8h时入侵率最高，但随着入侵时间的变长，子孢子的入侵率逐渐降低，因此选择在子孢子接种细胞后8-12h检测子孢子的入侵率。优选的，所述子孢子在荧光标记后的48小时内用于接种DF-I细胞。因为随着标记子孢子保存时间的延长，入侵活力逐渐降低。在本专利技术的另一方面，还提供了一种上述球虫细胞培养模型的应用，用于筛选抗球虫药物。本专利技术的球虫细胞培养模型，子孢子对DF-I细胞的入侵能力强，可用于建立客观衡量子孢子入侵活力的检测方法。该球虫细胞培养模型不仅适用于抗球虫药物的筛选，而且适用于对球虫发育过程中的基因或蛋白功能的研究。附图说明下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步详细的说明。图1是本专利技术实施例2接种柔嫩艾美耳球虫子孢子的DF-I细胞图；图2是本专利技术实施例3建立柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵活力检测体系的荧光显微镜图及流式细胞仪检测结果图；图3是本专利技术实施例3柔嫩艾美耳球虫子孢子接种DF-I细胞后不同检测时间的子孢子入侵率曲线图；图4是本专利技术实施例3柔嫩艾美耳球虫子孢子保存时间与入侵活力的曲线图；图5是本专利技术实施例3柔嫩艾美耳球虫子孢子在37°C和41°C培养温度下对五种细胞的入侵率柱状图；图6是本专利技术实施例4四种培养基对柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵率的影响的柱状4图7是本专利技术实施例4细胞铺板量对柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵率的影响的曲线图；图8是本专利技术实施例4柔嫩艾美耳球虫子孢子接种剂量对入侵率的影响的曲线图；图9是本专利技术实施例4培养基中添加血清量对柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵率的影响的曲线图；图10是本专利技术实施例5不同浓度的子孢子多抗对子孢子入侵的免疫抑制作用曲线图；图11是本专利技术实施例6不同浓度的三元代吡咯类药物对子孢子入侵的抑制作用曲线图。具体实施例方式本专利技术首次将鸡胚成纤维细胞培养体系(DF-I)应用于球虫体外细胞培养，发育至第1代裂殖子，建立了新的适合柔嫩艾美耳球虫发育的体外细胞培养模型，并将其作为研究子孢子入侵活力检测的平台进行培养条件优化，应用于球虫子孢子的入侵功能研究。 本专利技术球虫体外细胞培养模型可用于抗球虫药物的筛选，也可用于对球虫发育过程中的基因或蛋白功能的研究。实施例1柔嫩艾美耳球虫子孢子的收集和纯化卵囊的纯化参照《高级寄生虫学实验指导》球虫卵囊的分离纯化技术，在实验操作过程中略做修改(索勋等，2006)。(1)将柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊按IX IO4个/只接种14日龄无球虫雏鸡，在感染后第8天剖杀鸡取盲肠收集未孢子化卵囊，28°C培养至完全孢子化，收集孢子化卵囊置于4°C保存，保存期为1-2月。(2)4°C保存的E. tenella孢子化卵囊，室温，2500r/min离心lOmin。去除重铬酸钾后，沉淀中加入适量的蒸馏水，悬浮沉淀，2500r/min离心lOmin，去上清液。重复几次，以尽量除去残留的重铬酸钾。(3)弃上清，沉淀中加入30%的次氯酸钠，搅拌均勻后室温下静止30min，吸取液体上方的白色悬浮物。(4)力卩 10 倍量的灭菌 HBBS (KCl 0. 4g/L, KH2PO4O. 06g/L, NaCl 8. Og/L, NaHCO3O. 35g/L)稀释，3500r/min离心lOmin，沉淀用灭菌HBBS洗涤2 3次后，除去次氯酸钠，收集孢子化卵囊。子孢子的制备参照宋翠萍等(1998)建立的方法，在操作过程中做了相应的修改。(1)将纯化的孢子化卵囊，用玻璃勻浆器破碎卵囊，PBS洗本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种球虫细胞培养模型，其特征在于，所述球虫细胞培养模型是通过将柔嫩艾美耳球虫子孢子接种入鸡胚成纤维细胞系ＤＦ－１细胞，并使其在ＤＦ－１细胞中发育至第一代裂殖子而建成。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：姜连连，黄兵，韩红玉，董辉，赵其平，朱顺海，马卫娇，曾艳波，程军，李婷，孔春林，
申请(专利权)人：中国农业科学院上海兽医研究所，
类型：发明
国别省市：31
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