一种用农杆菌介导对裂壶藻进行基因转化的方法技术

本发明专利技术公开了一种用农杆菌介导对裂壶藻进行基因转化的方法。本发明专利技术提供的方法包括如下步骤：用重组农杆菌转化裂壶藻原生质体，得到转基因裂壶藻；所述重组农杆菌是将含有外源基因的质粒转化农杆菌得到的。本发明专利技术不需要涉及昂贵的仪器，易于操作，重复性好，且转化效率高，每107个藻体细胞可获得100个以上的转化子。本发明专利技术的建立为利用转基因技术改善裂壶藻的品质，获得生长速度快、油脂含量高、组分简单的裂壶藻新品种奠定了良好的基础。本发明专利技术方法对裂壶藻的遗传改良具有十分重要的意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术 属于基因工程领域，涉及。
技术介绍
二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid，简称DHA)是重要的ω-3高度不饱和脂肪酸，具有促进脑细胞生长发育，降血脂，降血糖，保护视力，抗癌及提高免疫能力等多种重要的生理功能，受到医疗界及食品界的广泛关注。商业化DHA的主要来源是深海鱼油，但深海鱼类资源有限，且鱼油中DHA含量受鱼的品种、季节及地理位置的影响而不稳定，不能满足日益增长的市场需求。利用微生物发酵法生产DHA具有周期短，脂肪酸构成简单，不受原料的限制，易于提纯等优点，有望成为高纯度DHA的有效来源。裂壶藻是一种海洋微藻，与硅藻、褐藻等微藻同属Stramenopiles纲。裂壶藻可利用葡萄糖为碳源进行异养培养，其营养细胞进行连续二均分裂，脂肪酸组成简单，DHA含量高，分离纯化简单，是获取天然高浓度DHA的很好资源。基因工程技术是近年来兴起的一种现代生物技术，该技术在育种领域里已取得了一些重大成果并获得了显著的经济效益，获得了许多性状优良的品种。利用转基因技术来改善裂壶藻的品质，获得生长速度快、油脂含量高、组分简单的裂壶藻新品种将具有巨大的商业优势和广阔的市场前景，所以利用现代基因工程技术提高裂壶藻的品质显得异常重要。但是，目前裂壶藻的基因工程领域尚处于空白。虽然裂壶藻的基因枪转化和电击转化方法已经建立，但是这些方法介导的重组方式为同源重组，因此需要从裂壶藻体内克隆获得同源片段，由于缺乏裂壶藻的基因组序列信息，极大的限制了上述两种转化方法的应用。因此，发展新的裂壶藻非同源重组基因转化方法将极大的推进裂壶藻基因工程领域的发展。专利技术内容本专利技术的目的是提供。本专利技术提供了一种制备转基因裂壶藻的方法，包括如下步骤用重组农杆菌转化裂壶藻原生质体，得到转基因裂壶藻；所述重组农杆菌是将含有外源基因的质粒转化出发农杆菌得到的。所述出发农杆菌可为农杆菌菌株LBA4404。所述裂壶藻具体可为裂壶藻Schizochytrium sp. TI01101 CGMCC No. 4603。所述裂壶藻原生质体的制备方法可包括如下步骤(1)将所述裂壶藻培养至对数生长期；(2)收集所述裂壶藻的细胞，用纤维素酶和蜗牛酶消化，获得裂壶藻原生质体。在进行所述步骤(1)前，可将所述裂壶藻进行预培养。所述预培养具体可为将所述裂壶藻接种于YPD培养基中，28°C摇床中培养过夜。所述步骤(1)中，所述培养温度可为28°C。所述步骤(1)中，具体可 采用YPD培养基培养所述裂壶藻。所述步骤(2)中，可通过离心收集所述裂壶藻的细胞。所述离心的参数具体可为 4000rpm、4°C离心5min。所述步骤(2)中，收集所述裂壶藻后进行所述消化前，可先用预冷的无菌水洗涤所述细胞。所述步骤(2)中，所述消化的条件具体可为28°C消化5-6小时。 所述步骤(2)中，所述纤维素酶和所述蜗牛酶具体可通过酶处理液的方式加入；所述酶处理液由溶质和溶剂组成；所述溶剂为20mM磷酸盐缓冲液(pH5.8)；所述溶质及其浓度如下 2% (质量百分比)纤维素酶，2% (质量百分比)蜗牛酶和0.7MKC1。所述用重组农杆菌转化裂壶藻原生质体可包括如下步骤①用乙酰丁香酮对重组农杆菌进行预诱导；②将所述裂壶藻原生质体与完成步骤①的重组农杆菌共培养，得到转基因裂壶藻。进行所述步骤①前，可将所述重组农杆菌在YEB培养基中，28°C震荡培养至对数生长期，然后离心收集重组农杆菌菌体。所述步骤①中，所述预诱导的培养条件可为28°C培养4-5小时。所述步骤①可在诱导培养基IM中进行。所述重组农杆菌在所述诱导培养基IM 中的浓度为0D600 = 0. 6-0. 8，所述乙酰丁香酮在所述诱导培养基IM中的浓度为250umol/ L0所述步骤②中，所述共培养的条件可为28°C震荡培养10-18小时，具体可为28°C 震荡培养14小时。所述步骤②可在诱导培养基IM中进行。所述用重组农杆菌转化裂壶藻原生质体的方法还可包括将共培养后的菌液进行抗生素筛选的步骤。所述抗性筛选可采用如下条件28°C培养2-3天。所述抗生素筛选中的抗生素具体可由G418、氨苄青霉素和氯霉素组成。所述抗生素筛选优选采用YPD筛选培养基进行。所述诱导培养基IM由水和溶质组成；所述溶质及其在所述诱导培养基IM中的浓度如下=NaCl 0. 15g/L、MgSO4 · 7H20 0. 25g/L、K2HPO4 2. 28g/L、KH2PO4 1. 36g/L、CaCl2 · H2O 0. 078g/L、FeSO4 0. 0025g/L、(NH4)2SO4 0. 53g/L、葡萄糖 1. 98g/L、甘油 0. 54g/L、MES 7. 808g/L ；pH5. 3。所述YPD筛选培养基由YPD培养基、G418、氨苄青霉素和氯霉素组成，G418的浓度为300mg/L，氨苄青霉素的浓度为300mg/L，氯霉素的浓度为300mg/L。所述YEB培养基由水和溶质组成；所述溶质及其在所述YEB培养基中的浓度如下 5g/L 牛肉浸膏、lg/L 酵母提取物、5g/L 蛋白胨、5g/L 蔗糖、0. 5g/L MgSO4 · 7H20 ；pH7. 4。所述YPD培养基由水和溶质组成；所述溶质及其在所述YPD培养基中的浓度如下 10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨、20g/L葡萄糖，50% (体积百分比)海水；pH6. 2-6. 8。所述外源基因具体可为序列表的序列1所示的GUS基因、序列表的序列2所示的 NPTII基因和序列表的序列3所示的EGFP基因中的至少一种。所述外源基因为所述GUS基因和所述NPT II基因时，所述含有外源基因的质粒为双元载体PCAMBIA2301。所述外源基因为EGFP基因时，所述含有外源基因的质粒为重组质粒 PCAMBIA2301-EGFP ；所述重组质粒pCAMBIA2301_EGFP可为在双元载体pCAMBIA2301的多克隆位点插入TEFl-EGFP-CYC1片段得到的重组质粒。所述重组质粒pCAMBIA2301-EGFP具体可为在双元载体PCAMBIA2301的HindIII和BamHI酶切位点插入所述TEFl-EGFP-CYC1片段得到的重组质粒。所述TEF1-EGFP-CYC1片段自上游至下游依次包括序列表的序列4所示的组成型启动子TEF1、序列表的序列3所示的EGFP基因和序列表的序列5所示的转录终止子CYCl。所述TEFl-EGFP-CYC1片段具体可为用用限制性内切酶HindIII和BamHI双酶切重组质粒pBS-TEFl-EGFP-CYC1得到的小片段；所述重组质粒pBS_TEFl-EGFP-CYC1具体可为以克隆载体pBluescript II SK+为骨架质粒，在EcoRI和PstI位点之间插入序列表的序列3所示的EGFP基因，在HindIII和EcoRI位点之间插入序列表的序列4所示的组成型启动子TEF1，在PstI和BamHI位点之间插入序列表的序列5所示的转录终止子CYC1。以上任一所述方法得到的转基因裂壶藻也属于本专利技术的保护范围。本专利技术提供了一种高效、稳定、简便的裂壶藻基因转化的方法。本专利技术以裂壶藻原生质体为受体材料，通过农杆菌LBA4404介导外源基因转化裂壶藻，巧本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种制备转基因裂壶藻的方法，包括如下步骤：用重组农杆菌转化裂壶藻原生质体，得到转基因裂壶藻；所述重组农杆菌是将含有外源基因的质粒转化农杆菌得到的。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：林祥志，程汝滨，马瑞娟，林汝榕，张林，吴欣，荣辉，李科，王昭凯，马涌，杨善军，
申请(专利权)人：国家海洋局第三海洋研究所，
类型：发明
国别省市：92