本发明专利技术提供APRT家族基因在植物细胞分裂素毒性、细胞分裂素代谢调控或作为抗性筛选标记方面的应用，所述APRT家族基因包括拟南芥基因APT1、其同源基因APT2、APT3、APT4和/或APT5。敲除APT1基因可以避免细胞分裂素的毒副作用，APRT类基因功能丧失的植物可以作为细胞分裂素毒性耐受品系用于农业育种。APRT家族基因可以被用来调控细胞分裂素的代谢，从而调节植物的生长发育过程，例如细胞分裂和分化，组织脱分化和再分化，根冠比例，叶片衰老等。此外，APRT家族基因可以作为抗性筛选标记基因。高浓度细胞分裂素处理条件下过量表达APT1蛋白即造成代谢毒性，但APT1蛋白本身对植物无毒性，符合作为筛选标记基因的特点，并且可以进行负筛选。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程领域，具体地说，涉及APRT家族基因在植物细胞分裂素毒性方面的应用。
技术介绍
自从上世纪五十年代激动素被发现以来，多种类型的细胞分裂素作为一类重要的植物生长调节物质被广泛应用于农业生产和组织培养中。实践中常用的细胞分裂素包括激动素和6-苄基腺嘌呤等。作为植物激素，微量的施用就能起到明显的效果。在实际中施加的浓度往往远高于细胞分裂素的生理浓度。这一方面是考虑到药物的可溶和渗透性，另一方面考虑到药效的持久性。但在应用过程中，由于细胞分裂素的施用不当，往往造成植物的毒副作用。这是在激素应用过程中不可忽视的问题。在拟南芥中的研究对细胞分裂素的相关副作用有了一定的认识。低浓度施加细胞分裂素后，可以刺激另一种植物激素乙烯的合成，而乙烯是逆境条件下用来抑制植物生长的一种重要的激素。乙烯生物合成的增加可以抑制植物的营养生长，使叶面积减小，光合作用强度下降，从而对植物产量增加不利。而高浓度的细胞分裂素的施加不仅能促进乙烯合成的增加，还会产生一些未知的毒性作用。但是关于细胞分裂素的毒性机理并没有完全的理解。细胞分裂素的毒性作用是由遗传控制的。这在之前的研究中有所暗示。Fabien Nogue等人建立了一套细胞分裂素的生物测定法。他们利用了一种烟草突变体zeal，细胞分裂素可以促进幼苗子叶和下胚轴部位的增厚增肥生长，而且这种生长的促进作用与细胞分裂素的浓度有很好的正相关性。但是在野生型烟草中这种促进作用并不能看到，这是由于野生型的烟草对细胞分裂素的毒性作用是敏感的。高浓度的细胞分裂素可以抑制野生型烟草的生长甚至杀死植株。虽然其中具体的分子机制并不清楚，但是这一现象告诉我们细胞分裂素对植物的毒害依赖于某些内源基因的功能。这些基因及所参与调控的生理过程正是需要我们去认识和研究的内容。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供APRT家族基因在植物细胞分裂素毒性、细胞分裂素代谢调控或作为抗性筛选标记方面的应用。为了实现本专利技术目的，本专利技术提供APRT(adenine phosphoribosyltransferase) 家族基因在植物细胞分裂素毒性、细胞分裂素代谢调控或作为抗性筛选标记方面的应用， 所述APRT家族基因包括拟南芥基因APTl (adenine phosphoribosyltransferase 1)、其同源基因 APT2、APT3、APT4 和 / 或 APT5.其中，所述的基因APT 1在Genebank中的编号为At 1 g27450，基因CDS长度为 732bp，编码243个氨基酸的蛋白，其核苷酸序列如Seq IDNo :1所示。APT2在Genebank中的编号为Atlg80050，基因CDS长度为579bp，编码192个氨基酸的蛋白，其核苷酸 序列如Seq ID No:2所示。APT3在Genebank中的编号为At4g22570，基因CDS长度为552bp，编码183个氨基酸的蛋白，其核苷酸序列如Seq ID No:3所示。APT4在Genebank中的编号At4gl2440，基因CDS长度为549bp，编码182个氨基酸的蛋白，其核苷酸序列如Seq ID No:4所示。APT5在Genebank中的编号为At5gl 1160，基因CDS长度为576bp，编码191个氨基酸的蛋白，其核苷酸序列如Seq ID No:5所示。进一步的，本专利技术提供拟南芥基因APT1、其同源基因APT2、APT3、APT4和/或APT5 在制备细胞分裂素毒性敏感型或不敏感型转基因植物方面的应用。进一步的，本专利技术提供拟南芥基因APT1、其同源基因APT2、APT3、APT4和/或 APT5在培育从代谢上调控腺嘌呤和/或细胞分裂素水平的转基因植物方面的应用，其是将 APT1、APT2、APT3、APT4和/或APT5基因全长克隆到不同种类的表达载体上，然后用这些表达载体转化植物，获得细胞分裂素代谢和/或腺嘌呤代谢调控相关的转基因植物。进一步的，本专利技术提供通过敲除APRT家族基因增强植物细胞分裂素抗性或减少毒副作用方面的应用。另外，本专利技术还提供一种改造的APTl基因，APTl蛋白第90位的甲硫氨酸与细胞分裂素的代谢偏好有相关性，对第90位的氨基酸进行替换，例如替换成缬氨酸和异亮氨酸， 以改变APTl酶识别特异性底物的能力。本专利技术利用拟南芥的分子遗传学研究优势，在拟南芥中研究了细胞分裂素致毒的机理。发现拟南芥APTl基因(Atlg27450)是使细胞分裂素产生细胞毒性的关键酶，这一基因属于腺嘌呤核糖磷酸转移酶APRT家族。在APTl的催化下，自由碱基形式的细胞分裂素被转化为核苷酸形式的细胞分裂素。细胞分裂素是腺嘌呤的衍生物。在植物体内，腺嘌呤核苷酸参与了多种重要的生理过程，如ATP的合成，核酸的代谢等。其实这些小分子的腺嘌呤衍生物本身并不是产生毒性的直接分子，而经过植物体内APRT类酶的代谢之后可以变成正常代谢的竞争性分子，从而产生毒性。同理过量的细胞分裂素的施加也会导致细胞毒性。之前人们利用一些腺嘌呤衍生物可以致毒，推测具有相同的机理。细胞分裂素对植物生长和发育起到关键的调控作用，而对于细胞分裂素生理功能的精确的时空调节是植物完成正常生活必需的。APTl是潜在的调控体内细胞分裂素代谢的工具，在体内的细胞分裂素代谢中也有着重要的作用。前述的细胞分裂素为玉米素、异戊烯基腺嘌呤、6-苄基腺嘌呤或激动素等。本专利技术对拟南芥中的APRT基因家族各成员的功能分化有了新的理解。拟南芥 APRT基因家族中有5个基因，包括ΑΡΤΙ、APT2、APT3、APT4和APT5。其中APTl对细胞分裂素和腺嘌呤代谢中功能是最强的。已知这五个酶的突变体中只有APTl的突变体具有明显的发育缺陷。aptl突变体有发育迟缓和雄性不育的表型。这主要是由于腺嘌呤代谢的缺陷而并非是由于细胞分裂素代谢的缺陷。本专利技术中发现APTl蛋白多个保守氨基酸位点的替换都可以造成酶功能的丧失，包括G168E、L99F、G195D、G196R、P85T和R149K。本专利技术中发现APTl第90位的甲硫氨酸有可能是APTl偏好细胞分裂素的结构基础之一。APTl是一个多功能的酶，不只参与了腺嘌呤的代谢，还参与了细胞分裂素的代谢。 植物巧妙利用了同一种酶既调控了核苷酸的代谢，又调控了激素的代谢。对于植物激素的代谢是APRT类家族在进化过程中偶然获得的一种功能，事实上，在原核生物中和动物中并不需要有细胞分裂素类的代谢。但是由于植物激素的重要性，植物中的APRT家族对细胞分裂素的催化能力被保留下来，并有所加强。发现酵母中的APRT酶ScAPRT对腺嘌呤代谢的催化能力远强于拟南芥中APTl酶，但是APTl对细胞分裂素的催化活性要高于ScAPRT。决定APRT底物特异性的氨基酸对指导酶的设计改造有潜在的价值。本专利技术从分子水平找到了造成细胞分裂素应用毒副作用及调控细胞分裂素代谢的关键基因APTl。APTl基因及同一家族的APT2，APT3，APT4和APT5基因具有以下三个方面的应用第一，调控一种重要植物激素-细胞分裂素的代谢，从而可以对植物生长发育中涉及细胞分裂素作用的生理过程进行调控，例如细胞分裂和分化，组织脱分化和再分化，根冠比例，叶片衰老等。第二，通过敲除APTl基因增强细胞分本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．ＡＰＲＴ家族基因在植物细胞分裂素毒性、细胞分裂素代谢调控或作为抗性筛选标记方面的应用，其特征在于，所述ＡＰＲＴ家族基因包括拟南芥基因ＡＰＴ１、其同源基因ＡＰＴ２、ＡＰＴ３、ＡＰＴ４和／或ＡＰＴ５。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：郭红卫，张新岩，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：11
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