本发明专利技术公开了一种用于生产外源蛋白的山羊β-乳球蛋白基因座打靶载体构建方法，以山羊β-乳球蛋白基因5’端调控序列BLG5作为5’端同源臂，以山羊β-乳球蛋白基因3’端包含第6、第7外显子及下游的序列BLG3作为3’端同源臂，以第5外显子和第5内含子的部分序列E5作为连接序列用以将正筛选标记基因置于第5内含子中；将BLG5、目的基因及E5顺次连接，再和BLG3分别连接到通用型打靶载体中正筛选标记两侧。在需要时可以将目标蛋白的基因组DNA或cDNA序列插入到该通用打靶载体的目的基因位置处或直接置换掉原来的目的基因，然后用所获得的打靶载体转染山羊胎儿成纤维细胞或其他细胞，筛选出中靶的细胞，通过体细胞核移植技术获得能在乳腺中生产目标蛋白的转基因山羊。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一类通过同源重组将外源目的基因定向整合到山羊β-乳球蛋白基因座的基因打靶载体构建方法，属于生物
技术介绍
转基因技术能够在基因水平对家畜的基因组进行遗传修饰，从而迅速改变家畜的性状。例如整合有生长激素基因的转基因猪在生长发育和饲料利用率等方面得到了明显地改善，而转溶葡萄球菌酶基因的山羊对乳腺炎的抗性也明显得到增强。1987年，Gorden 等成功将人组织纤维酶原激活剂表达于小鼠乳腺中，建立了第一例基于小鼠的乳腺生物反应器。由于乳汁产量大、对动物自身没有损伤，且外源蛋白易于分离纯化而使得乳腺生物反应器得到了人们的重视。2006年，第一个利用转基因动物乳腺生物反应器生产的重组人抗凝血酶III(ATryn)获准上市更是激发了人们的研究热情。然而，到目前为止所得到的转基因家畜大都是采用随机整合的方式，即目的基因在转基因动物基因组中的整合位点和拷贝数都是随机的。这就造成了目的基因在转基因动物中的表达水平不均一，有高有低，甚至由于受到位置效应的影响而无法表达。另外，由于人们对相关基因的调控序列研究尚不完全清楚，为了尽可能的包含到这些调控序列往往采用足够长的基因片段来作为调控序列，这无形中又增加了操作的难度，同时插入的外源基因片段还可能会影响基因组中相邻基因的表达，存在诱发癌症等的风险。而基于同源重组的基因打靶技术可以实现对基因组的定向修饰，不仅能够很好的解决上述问题，同时也能够更加充分的利用靶位点的内源性调控序列，实现目标蛋白更加高效的表达。目前，基因打靶技术在小鼠上的研究应用比较成熟，在研究基因和\或蛋白功能、 构建人类疾病的动物模型等方面发挥了重要作用。然而，家畜中尚没有胚胎干细胞可供使用，制约了基因打靶技术在家畜中的研究应用。1996年，克隆羊“多莉”的降生为研究基因打靶家畜开辟了另一条途径首先用打靶载体转染家畜体细胞，筛选得到打靶阳性细胞后通过体细胞核移植技术生产基因打靶的胚胎，再借助胚胎移植技术将基因打靶胚胎移植至代孕母畜子宫中进而获得基因打靶家畜。2000年，McGreath等借助于该技术成功将人 α 1-抗胰蛋白酶基因(AAT)定位整合于绵羊的原胶原基因座，获得了高表达AAT的基因打靶绵羊。随后，敲除α-1，3-半乳糖苷转移酶用以为人类提供移植器官的猪、敲除朊蛋白基因(Prp)以抵御疯牛病的奶牛、敲除囊性纤维化跨膜通道调节因子(CFTR)以用以研究人囊性纤化的模型猪、缺失免疫球蛋白重链和轻链用以生产人源化抗体的猪和牛等相继诞生， 为构建乳腺生物反应器生产药用蛋白、生产器官移植动物、培育高产、抗病家畜新品种\品系奠定了基础。β-乳球蛋白是山羊乳中主要的乳清蛋白，在乳汁中的分泌量可达2. 3g/L。截至目前，尚未见到通过基因打靶的方式应用其内源性调控序列指导外源目的蛋白表达的报3道。作为基因打靶的载体，应该具有良好的筛选标记、方便筛选阳性克隆、无毒副作用并方便后续操作。现有的阳性细胞富集策略以启动子缺失的方法最为有效，在家畜中对α-1， 3-半乳糖苷转移酶、朊蛋白等基因位点的敲除研究即是采用启动子缺失的方法来富集阳性细胞。然而构建乳腺生物反应器所需的乳蛋白启动子在目前通常使用的打靶细胞——胎儿成纤维中并不表达，这就限制了启动子缺失富集策略的应用，这时以正负筛选方法来构建打靶载体便成为首选。相较而言，正负筛选的富集策略对基因是否转录没有要求，适用范围更加广泛。有研究表明，载体中的筛选基因会影响其整合位点邻近基因的正常表达，而且出于动物福利的考虑也需要在后续的研究中将筛选基因等附属基因结构剔除。目前，通常采用Cre/loxp系统和FLP/FTR系统来达到将筛选标记基因剔除的目的。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，构建一种能够充分利用山羊β -乳球蛋白基因内源性调控序列的基因打靶载体，将外源性目的定位置于这些调控序列调控之下，从而使目的基因得到更加高效地表达。为构建乳腺生物反应器和抗乳腺炎等奠定基础。为了实现上述目标，本专利技术采取了以下方案以山羊β -乳球蛋白基因5’端调控序列(BLG5)作为5’端同源臂，以山羊β -乳球蛋白基因3’端包含第6、第7外显子及下游的序列(BLG3)作为3’端同源臂，以第5外显子和第5内含子的部分序列(Ε5)作为连接序列用以将正筛选标记基因置于第5内含子中。将BLG5、目的基因及Ε5顺次连接，再和BLG3分别连接到通用型打靶载体(如 ploxpll)中正筛选标记两侧。目的基因可以是包含起始密码子和终止密码子的基因组DNA、cDNA或其他人工合成拼接的DNA片段。正筛选标记可以是新霉素(Neo)、潮霉素(Hyg)、嘌呤霉素(puro)、绿色荧光蛋白 (GFP)中的一种或几种。为了方便在后续工作中剔除正筛选标记，可以在正筛选标记基因两侧分别引入一段同向的Ioxp序列。为了增加阳性克隆的富集率，可以在其中一个或两个同源臂的外侧引入负筛选标记基因，如胸苷激本酶(tk)或白喉毒素(DT)基因。通过构建同源重组将外源目的基因定向整合到山羊β-乳球蛋白基因座的基因打靶载体，以借助山羊乳腺生产外源目的蛋白或培育高产、抗病奶山羊新品种。将本方法构建得到的载体转染山羊胎儿成纤维细胞或其他山羊细胞，筛选出中靶细胞，用于核移植生产转基因动物，使获得的山羊能在乳腺中表达外源蛋白或具有高产、抗病特性。在需要时可以将目标蛋白的基因组DNA或cDNA序列插入到该通用打靶载体的目的基因位置处或直接置换掉原来的目的基因，然后用所获得的打靶载体转染山羊胎儿成纤维细胞或其他细胞，筛选出中靶的细胞，通过体细胞核移植技术获得能在乳腺中生产目标蛋白的转基因山羊。附图说明图1打靶载体示意图2打靶载体构建流程示意图；图中pB5T为将BLG5连接到pMD18 T simple载体中的得到的载体，PAEKS是将ALA和E5连接到pBluescript KS(-)中得到的载体，pB3T为将BLG3连接到pMD18 T simple中所得到的载体。ploxpll为一个通用型打靶载体。图3打靶载体的酶切鉴定图；1.为SmaI单切产物2.为EcoRI单切产物3.为 BamHI 单切产物 4.为 Ikb ladder Marker ；图4打靶载体中Ioxp序列生物活性鉴定图；pBAT-C为将pBAT转化组成性表达Cre 酶的BM25. 8菌株后所提取到的质粒。1&2. XhoI和MlI分别双酶切pBAT_C和pBAT的酶切产物；3&4. pBAT 和 pBAT-C 的 PCR 产物 M1&M2 为 DNA Marker。具体实施例方式以下结合具体实施例，对本专利技术进行详细说明。1使用的试剂、质粒与菌株本专利技术实施过程中使用了下列试剂及质粒菌株I^rimeSTAR HS DNA聚合酶、 T4DNA连接酶、限制性内切酶、pMD18 T-simple载体及DH5 α菌株均为I^akara公司产品， 琼脂糖凝胶胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒为Tiangen公司产品，PCR引物由上海捷瑞公司合成，序列测定由南京金斯瑞公司完成。ΒΜ25. 8菌株为Novagen公司产品，pBluescript KS (-)购自 Stratagene 公司。2设计和使用的引物表1引物序列及PCR反应相关参数片段名称引物退火本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．用于生产外源蛋白的山羊β－乳球蛋白基因座打靶载体构建方法，其特征在于，以山羊β－乳球蛋白基因５’端调控序列ＢＬＧ５作为５’端同源臂，以山羊β－乳球蛋白基因３’端包含第６、第７外显子及下游的序列ＢＬＧ３作为３’端同源臂，以第５外显子和第５内含子的部分序列Ｅ５作为连接序列用以将正筛选标记基因置于第５内含子中；将ＢＬＧ５、目的基因及Ｅ５顺次连接，再和ＢＬＧ３分别连接到通用型打靶载体中正筛选标记两侧。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：靳亚平，胡林勇，王爱华，张涌，李倩，陈华涛，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：87
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