以人类凝血酶生产纤维蛋白胶与血小板凝胶的制备方法技术

一种生产纤维蛋白胶的方法，其特征在于，包括：　　　　从单一捐血人血浆中制备凝血酶；及　　　　将凝血酶与单一捐血人的血浆冷冻沉淀物混合后制成纤维蛋白胶，或将凝血酶与病人本身血浆制成的冷冻沉淀物混合制成自体性的纤维蛋白胶。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术有关一种纤维蛋白胶与血小板凝胶的制备方法，尤其有关一种。(2)
技术介绍
纤维蛋白胶(Fibrin glue)又称为纤维蛋白封合物(Fibrin sealant)或纤维蛋白黏着剂(Fibrin adhesive)，其可以经由混合两种血浆成份--纤维蛋白原浓缩物(Fibrinogen concentrate)和凝血酶浓缩物(Thrombin concentrate)而得，已成为人类血浆最重要的制品之一。纤维蛋白胶是一种使用于局部的血浆制品，其为模拟凝血机制的最后一个步骤而最终行成一个纤维蛋白凝血块黏附于其所应用的局部组织。纤维蛋白胶有助于止血与伤口的愈合两种特性，因此其应用主要在医疗手术中，如伤口愈合、矫形手术、皮肤移植、骨头重建或烧烫伤治疗，在细胞培养(cell culture)方面可成为纤维原细胞(fibroblasts)、角质细胞(keratinocytes)等生医材料的培养基质。纤维蛋白胶相较于人工合成的黏着剂，如氰丙烯酸衍生物(cyanacrylatederivatives)或明胶-苯间二酚(雷琐辛)-甲醛化合物(gelatin-resorcinol-formaldehyde composite)等，纤维蛋白胶由于由血浆衍生而来，所以具有生物相容性及生物分解性的优点。因此，不会造成发炎反应(inflammatory reactions)、异物反应(foreign body reaction)、组织坏死(tissue necrosis)或严重纤维化(extensive fibrosis)，并在使用于伤口愈合数日到数周之间自然被人体所吸收。近年来，纤维蛋白胶已经成为医学界所注目的议题，其制造方式主要分为两种商业化大量制造的纤维蛋白胶产品与少量由外科医生自行制作的纤维蛋白胶(Home-brew fibrin glue)。传统商业化产品是由数千公升的人类集合血浆经工业化分馏制成，然而此种产品并不普及，同时具有病毒感染的危险性，因此在欧美有许多外科医生便发展出自制的纤维蛋白胶，由医院人员制备，把来自单一捐血者血浆的冷冻沉淀物或病患自身的血浆，与凝血酶相混合制成。然而，因缺乏人类血浆制成的凝血酶，因此后者的方法需要使用源自小牛血浆(Fetal bovine serum)的凝血酶，此为异种蛋白质，同时有种种的抗原性疑虑及病原蛋白颗粒(prion)感染的危险性，甚至引起严重的免疫反应和致命的出血，因为部份病人会发展出抗第五凝血因子抗体(anti-FV antibody)，而与其本身自身的第五凝血因子进行交叉反应。因此，就现阶段的纤维蛋白胶制备方法而言，仍然有其需要改进及克服的缺憾，极需新的研制方法来减轻或避免上述的问题。(3)
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种。本专利技术的生产纤维蛋白胶的方法，包括首先从单一捐血人血浆中制备凝血酶，之后与单一捐血人的血浆冷冻沉淀物混合后，即可制成单一捐血人的纤维蛋白胶；或者与病人本身血浆制成的冷冻沉淀物混合即可制成自体性的纤维蛋白胶。本专利技术的分为制备凝血酶与纤维蛋白胶两种，其中制备凝血酶的步骤包括利用全血捐血分离，或血浆分离术所得到的含正常柠檬酸盐抗凝剂血浆制备凝血酶；使用不同的浓度辅因子(co-factor)在金属或玻璃物质存在下，将凝血系统活化，使血浆中的第二凝血因子活化为凝血酶；决定活化的最佳条件，以控制凝血酶在最短的时间内形成，同时评估减低柠檬酸盐浓度的影响。本专利技术制备纤维蛋白胶的步骤包括当凝血酶完成制备后，与富含纤维蛋白原的人类冷冻沉淀物相混合产生纤维蛋白胶，该纤维蛋白胶的生产同样控制在以最短的时间内产生。本专利技术中制备凝血酶所用的血浆为单一捐血人的血浆，这样可以避免因血浆来源过于复杂，而受病毒污染的危险。本专利技术中所使用的冷冻沉淀物可为单一捐血人所提供，或由病患本身提供，由病患的冷冻沉淀物混合凝血酶制成的纤维蛋白胶为自体性纤维蛋白胶，不会有排斥性问题。本专利技术中影响活化的条件主要为决定氯化钙浓度、pH值、活化反应温度等其它辅因子的浓度。以上的纤维蛋白胶制备方法同时可应用于它种由血浆中制备的生物性黏着剂，如血小板凝胶等。(5)具体实施方式本专利技术的中，制备凝血酶时的步骤与所使用的最佳条件，以下列的实验操作来决定1.氯化钙(CaCl2)浓度的决定以20mM、50mM、80mM三种经评估过的最终浓度氯化钙溶液加入含有玻璃珠的血浆中，在数阶段时间控制下以活化血浆，的后将完成活化的血浆与冷冻沉淀物混合并测量生成纤维蛋白胶的反应时间，其结果如表一。表一 其中氯化钙溶液的适合浓度为接近20mM，与血浆的混合活化时间为少于30分钟，其形成纤维蛋白胶的时间皆短于其它浓度与其它阶段的时间控制下的情形，而当氯化钙溶液浓度在80mM时，纤维蛋白胶完全不会形成。因此，选择决定氯化钙溶液的最适浓度范围为70-10mM，混合的最适活化时间范围为5分钟至1小时；氯化钙溶液的最适浓度约为20mM。混合的最适活化时间约为15分钟。2.玻璃珠的存在与否当血浆中缺乏玻璃珠时，活化反应并不会发生，无凝血酶的产生，因为玻璃珠本身提供一带负电性质的表面有助于凝血因子的聚集活化成凝血酶。3.冰冻实验本阶段实验的目的为了解是否血浆可被氯化钙与凝血酶活化后，冰冻至-20℃保存直到使用时解冻到37℃以制造纤维蛋白胶。其结果如表二表二 因此，此种活化血浆可以被冰冻保存至须要制造纤维蛋白胶的时候。4.温度测试本阶段实验的目的为了解是否血浆活化时的温度影响纤维蛋白胶形成的时间，其中以四种经评估过的温度20℃、26℃、30℃、37℃进行温度测试，氯化钙溶液的浓度为20mM，混合的活化时间为15分钟，血浆中混合有玻璃珠，其结果如表三表三 *室温本专利技术中，活化血浆的温度范围可介于15-40℃。表三中显示，温度介于20～30℃为活化血浆、制造凝血酶的最佳温度范围。5.酸碱值测试本阶段实验的目的为确认酸碱值对血浆活化反应的影响，其中以盐酸和氢氧化钠来调整酸碱值，其它条件固定不变，如血浆中混合有玻璃珠，氯化钙溶液的浓度为20mM，混合的活化时间为15分钟等，然后经过活化的血浆与冷冻沉淀物混合，量测形成纤维蛋白胶的时间，其结果如表四。表四 表四的结果显示，当酸碱值在6.5～8.5之间对纤维蛋白胶的形成时间并无太大的影响，当酸碱值大于9时，凝血酶被抑制，因此无纤维蛋白胶的产生。所以血浆活化的酸碱度适当范围为6～8.8之间。6.血小板浓缩物(I)本阶段实验的目的为尝试以血小板浓缩物取代血浆来制造纤维蛋白胶，其中其它操作条件仍然如前面数阶段的实验相同，其结果如表五。表五 因此，即使在相同条件下，以活化后的血小板浓缩物再混合冷冻沉淀物，并不会产生纤维蛋白胶。7.血小板浓缩物(Π)由于前述实验中并无法产生纤维蛋白胶，因此本阶段的实验改变以血小板浓缩物取代冷冻沉淀物来制造血小板凝胶，其操作条件同样为血浆中混合有玻璃珠，氯化钙溶液的浓度20mM，混合的活化时间为15分钟，将活化后的血浆与血小板浓缩物混合观查血小板凝胶形成的时间，结果如表六。表六 因此活化血浆的条件方法同样适用于利用血小板浓缩物来制造血小板凝胶。8.添加氯化钙与氯化钠到冷冻沉淀物中本阶段实验的目的为在两种冷冻沉淀物---完全冷冻(cryo-rich)的血浆和血小板血浆(PRP本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：泰瑞·玻诺夫，
申请(专利权)人：新扬行实业有限公司，
类型：发明
国别省市：