本发明专利技术涉及一种人工生物瓣瓣膜的制备方法，属于生物材料领域。本发明专利技术以动物或人异体心脏瓣膜为原料，以化学方法脱去动物或人异体心脏瓣膜的细胞，得到脱细胞瓣膜的胞外基质材料。将此材料浸入不同浓度、不同比例的原花青素溶液中，在适当温度条件下，摇动交联，从而得到无毒性、不皱缩的人工生物瓣瓣膜材料，用作制备临床心脏瓣膜置换、修复和再生。本发明专利技术方法可通过调节交联剂原花青素溶液的浓度、交联的时间和清洗时间等，实现交联的力学强度、抗酶解能力、交联剂释放、促进组织再生能力等方面的可调控。本发明专利技术工艺简单易行，且便于推广。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种具有生物活性人工生物瓣瓣膜的制备方法，属生物医学工程领域。
技术介绍
心脏瓣膜病是危及人类健康的一种严重疾病，目前对于心脏瓣膜病人主要采用人工心脏瓣膜置换手术治疗[Julie R，Boris AN，Vacanti JP.Tissueengineeringa 21st century solution to surgical reconstruction.Annthorac surg，2001，72577-591.]。人工心脏瓣膜包括机械瓣和生物瓣两类，它们各有其成功和不足之处。机械瓣体内植入寿命可达25年之久，因而是目前使用最多的人工瓣膜。但机械瓣存在难以克服的严重缺陷，如非生理性、对正常血液流动状态的阻碍、手术后必须终身服用抗凝药物而引起的出血合并症、每年高达5％的血栓率、不能随青少年心脏发育长大而长大等。这些问题使机械瓣的使用潜伏着多项危险因素。也使国际上对人工心脏瓣膜的研究热点转向了生物瓣[Julie R，Boris AN，Vacanti JP.Tissue engineeringa 21st centurysolution to surgical reconstruction.Ann thorac surg，2001，72577-591.]。生物瓣是用与人体结构功能相近的动物或人的心脏瓣膜或心包膜加工而成的瓣膜假体[Schmidt CE，Baier JM.Acellular vascular tissuenaturalbiomaterals for tissue repair and tissue engineering.Biomaterals，2000，21(2000)2215-2231.]。就生物瓣来说，同种异体瓣临床应用成功率较高，但其来源有限；异种瓣虽来源广泛，但有抗原性，必须经过戊二醛交联处理才能使用。经戊二醛交联的猪主动脉瓣有一定的强度和韧性，基本保留了猪心脏瓣膜的胶原结构，减少了免疫原性，很大程度上避免了机械瓣置换后需终身抗凝的缺点。然而将这种瓣膜直接植入体内后，往往会出现严重的钙化，加之戊二醛处理后戊二醛本身的残留毒性以及瓣膜组织残留的免疫原性，极大地降低了其体内工作寿命[Schmidt CE，Baier JM.Acellular vascular tissuenatural biomaterals for tissue repair and tissue engineering.Biomaterals，2000，21(2000)2215-2231.]。另外，不经任何交联固定的脱细胞人工瓣膜容易传染某些病源菌或病毒病，如Creutzfeldt-Jakob氏病等缺点。Martin等和Walles等已检测并证实了猪内源性逆转录病毒可在人细胞内表达[Neuenschwander S，Hoerstrup SP.Heart valve tissue engineering.Transplant immunology，2004，12(3-4)359-365.]。因而急需一种新型的无毒、抗菌、抗病毒和抗炎的交联剂替代戊二醛交联天然瓣膜材料。以去垢剂、酶消化和超声清洗等方法彻底抽提动物瓣膜的细胞，保留由胶原蛋白、弹性蛋白、纤粘连蛋白(fibronectin)和层粘连蛋白(laminin)组成的天然三维支架结构，这种支架结构由于是细胞外基质，含有糖蛋白和蛋白聚糖等多种功能性蛋白，有较好的生物相容性。另外，这种支架保持了瓣膜天然形态，不象高分子材料支架需要根据血流动力学塑形[Schmidt CE，Baier JM.Acellular vascular tissuenatural biomaterals for tissue repair andtissue engineering.Biomaterals，2000，21(2000)2215-2231.]。但是，SYNERGRAFT公司采用这种不经任何交联固定工艺生产的人工瓣膜SYNERGRAFTTM，在应用于临床后，不但不能在体内原位再生出瓣膜内皮，反而引起强烈的免疫炎性反应，造成多例病人手术后1-2年内死亡的悲剧[Simon P.，Kasimir M.T.，Seebacher G.et al.Early failure of the tissue engineered porcine heartvalve SYNERGRAFTTMin pediatric patients.European Journal ofCardio-thoracic Surgery.23(2003)1002-1006.]。看来，应用天然脱细胞瓣膜材料也需要一种新型的无毒、抗菌、抗病毒和抗炎的交联剂对其交联处理。为克服上述缺陷，交联固定工艺是重要处理方法，人们已找到多种交联剂可交联处理动物瓣膜支架，如多聚环氧化物(PC)、丙三醇、α-氨基油酸(AOA)、NO-ReactTM、cyanimide、碳二亚胺(1-ethyl-3(-3 dimethyl aminopropyl)carbodiimide hydrochloride，EDC)、adipyl dichlorid、环己二异氰酸盐(hexamethylene diisocyanate，HMDC)、藻酸叠氮化物(alginate azide)和藻酸钠(sodium alginate)等[Julie R，Boris AN，Vacanti JP.Tissueengineeringa 21st century solution to surgical reconstruction.Annthorac surg，2001，72577-591.，Schmidt CE，Baier JM.Acellular vasculartissuenatural biomaterals for tissue repair and tissue engineering.Biomaterals，2000，21(2000)2215-2231.]，但是由于其交联效果、交联剂本身的毒性等原因，使交联所得生物瓣的性能仍不理想。所以仍须寻找到更加适合的交联剂，使交联处理的瓣膜具有适当的力学特性、较强的稳定性和耐久性、较低的毒性，利于瓣膜组成细胞的长入，以及能够抗菌、抗病毒、抗炎等。原花青素是一类广泛存在于水果、蔬菜、花瓣、种子以及树皮中的植物次生代谢产物，也是红葡萄酒的重要成分，被用作食品、天然抗氧化物和药品等，可清除自由基、保护心脑血管，具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗癌等活性，其体内代谢途径清楚，而且没有毒性[Packer L.，Rimbach，and Virgili F.Antioxidantactivity and biologic properties of a procyanidin-rich extract from pine(Pinus Maritima)bark，pycnogenol.Free Radical Biology &Medicine，27(5/6)704-724，1999.]。虽然Nimni等证明原花青素可用来交联牛肌腱和心包膜等[Bo Han，Jason Jaurequi，Bao Wei本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种具有生物活性的人工生物瓣瓣膜的制备方法，包括交联前处理、交联和交联后处理及保存，其特征在于采用原花青素作为联剂交联脱细胞心脏瓣膜，其方法是按每片瓣膜浸泡于１－２０ｍｌ，含原花青素为０．０１－２０ｍｇ／ｍｌ的Ｄ－Ｈａｎｋｓ液溶液，作脱细胞心脏瓣膜交联；交联脱细胞心脏瓣膜的温度１－４０℃，交联在摇床摇动条件下完成，其摇动速度为１０－３００ｒｐｍ，交联时间为１分钟－２４０小时；所述的Ｄ－Ｈａｎｋｓ为无Ｃａ↑［＋］、Ｍｇ↑［＋］的离子的磷酸缓冲溶液，其组成为ＫＣｌ０．４ｇ／Ｌ，ＫＨ↓［２］ＰＯ↓［４］４０．０６ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ８．００ｇ／Ｌ，ＮａＨＣＯ↓［３］０．３５ｇ／Ｌ，Ｎａ↓［２］ＨＰＯ↓［４］.７Ｈ↓［２］Ｏ０．０９ｇ／Ｌ，酚红０或０．０１ｇ／Ｌ。
【技术特征摘要】
1.一种具有生物活性的人工生物瓣瓣膜的制备方法，包括交联前处理、交联和交联后处理及保存，其特征在于采用原花青素作为联剂交联脱细胞心脏瓣膜，其方法是按每片瓣膜浸泡于1-20ml，含原花青素为0.01-20mg/ml的D-Hanks液溶液，作脱细胞心脏瓣膜交联；交联脱细胞心脏瓣膜的温度1-40℃，交联在摇床摇动条件下完成，其摇动速度为10-300rpm，交联时间为1分钟-240小时；所述的D-Hanks为无Ca+、Mg+的离子的磷酸缓冲溶液，其组成为KCl 0.4g/L，KH2PO440.06g/L，NaCl 8.00g/L，NaHCO30.35g/L，Na2HPO4·7H2O 0.09g/L，酚红0或0.01g/L。2.按权利要求1所述的具有生物活性的人工生物瓣瓣膜的制备方法，其特征在于按每片瓣膜浸泡于1-10ml的含原花青素为0.06-10mg/ml的无Ca+、Mg+的离子的磷酸缓冲溶液。3.按权利要求1所述的具有生物活性的人工生物瓣瓣膜的制备方法，其特征在于交联前处理包含心脏瓣膜原材料收集与脱细胞处理和前处理，步骤是(a)清洗在屠宰场将刚宰杀的猪心脏内主动脉瓣膜或肺动脉瓣膜连同周围血管剪下，置于无Ca2+、Mg2+离子的磷酸缓冲溶液中于4℃下1小时内带回，并剪取瓣膜叶片，用D-Hanks液清洗干净；(b)脱细胞脱细胞液分A液和B液，都以D-Hanks液为基配制。瓣膜分两步脱细胞，第一步用A液，第二步用B液；每一步均按每片瓣膜加入2-20ml的比例加入；脱细胞液A液从以下三种溶液配方中的任选一种配方1，含0.05％或0.1％胰蛋白酶、0...
【专利技术属性】
技术研发人员：常江，翟万银，
申请(专利权)人：中国科学院上海硅酸盐研究所，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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