一种检测血清样本中结核抗体的蛋白悬浮芯片系统技术方案

本实用新型专利技术公开了一种检测血清样本中结核抗体的蛋白悬浮芯片系统，包括：芯片基体、加液系统、悬浮芯片检测仪和计算机，芯片基体内装有相关缓冲溶液和待测抗体，相关缓冲液中设置有编码微球，编码微球上包被捕获抗原，加液系统依次向芯片基体中加入生物素标记的二抗、荧光信号检测物，悬浮芯片检测仪包括微细管检测通道和检测激光，编码微球依次通过微细管检测通道，检测激光激发并识别编码微球的颜色及其上待测物的颜色，计算机与悬浮芯片检测仪相连，并记录、分析悬浮芯片检测仪的测量结果。悬浮芯片技术利用微球在溶液中反应，利用激光检测技术，提高了样品检测的准确性和重复性，具有优于片膜芯片的操作简便、重复性好等特点。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本技术涉及一种检测血清样本中结核抗体的蛋白悬浮芯片系统。
技术介绍
结核分枝杆菌(M.tuberculosis，TB)，俗称结核杆菌，是引起结核病的病原菌。可侵犯全身各器官，但以肺结核为最多见。结核病至今仍为重要的传染病。估计世界人口中1/3感染结核分枝杆菌。据WHO报道，每年约有800万新病例发生，至少有300万人死于该病。我国建国前死亡率达200-300人/10万，居各种疾病死亡原因之首，建国后人民生活水平提高，卫生状态改善，特别是开展了群防群治，儿童普遍接种卡介苗，结核病的发病率和死亡率大为降低。但应注意，世界上有些地区因艾滋病、吸毒、免疫抑制剂的应用、酗酒和贫困等原因，发病率又有上升趋势。重组结核分枝杆菌16KD蛋白和结核分枝杆菌38KD蛋白及LAM 3种抗原均为结核杆菌特异性较高的抗原，存在于结核杆菌复合群中，具有较强的免疫原性，适用于血清学诊断，近年来，免疫诊断方法研究得较多，如酶联免疫吸附试验(ELISA)、斑点免疫渗滤试验(DIGFA)、免疫印迹试验(Western blot)和斑点免疫层析试验(DICA)等，大都采用上述抗原之一。免疫学方法酶联免疫实验(ELISA)中利用抗原与抗体特异性反应来检测抗原或抗体主要有由双抗原夹心测抗体、双抗体夹心测抗原、竞争法、间接法等。间接法测抗体的原理是特异性抗原结合到固相载体上，然后和待检血清中的相应抗体结合形成免疫复合物，洗涤后再加酶标记二抗与免疫复合物中的抗体结合形成酶标记二抗-抗体-固相抗原复合物，加底物显色，判断抗体含量。悬浮芯片(suspension array)也称液相芯片，是20世纪70年代美国Luminex公司研制出的新一代生物芯片技术，利用带编码的微球体作为载体，流式细胞仪作为检测平台，对核酸、蛋白质等生物分子进行大规模测定。目前，该技术已广泛应用于免疫分析、核酸研究、酶学分析、抗体筛选及受体与配体的识别分析等领域。目前发展的悬浮芯片主要是基于实验室检测方法的建立和方法评价及优化，以缩短检测时间，降低方法的检测成本。但是蛋白悬浮芯片方法是否能够检测人血清中的结核抗体，其定量检测能力如何，尚缺乏模型和评价。
技术实现思路
本技术的目的在于提供一种检测血清中结核抗体的蛋白悬浮芯片系统，该芯片系统包括：芯片基体、加液系统、悬浮芯片检测仪和计算机，其中，芯片基体内装有相关缓冲溶液和待测抗体，相关缓冲液中设置有027号编码微球，编码微球上包被有捕获抗原，加液系统依次向芯片基体中加入生物素标记的二抗、荧光信号检测物，悬浮芯片检测仪包括微细管检测通道和检测激光，反应后的溶液吸入到微细管检测通道中，以使得每个编码微球依次通过微细管检测通道，检测激光激发并识别编码微球的颜色及其上待测物的荧光信-->号，计算机与悬浮芯片检测仪相连，并记录、分析悬浮芯片检测仪的测量结果。进一步，所述相关缓冲溶液包括用于所述待测抗体稀释的样品稀释液、稀释所述编码微球所用的微球稀释液、稀释所述生物素标记的二抗所用的抗体稀释液、每个反应之后洗涤编码微球所用的微球清洗液、SA-PE稀释液、检测缓冲液。进一步，所述捕获抗原优选为结核分枝杆菌的16KD和38KD蛋白。进一步，所述待测抗体为血清样品。进一步，所述生物素标记的二抗优选为Biotin-羊抗兔和/或Biotin-羊抗人IgG。进一步，所述荧光信号检测物为链亲和素-藻红蛋白。进一步，所述芯片基体为96孔滤板或者微量离心管。进一步，所述检测激光包括用激发所述编码微球基质中的颜色、识别编码微球分类编码以确定检测项目的红色激光，用于激发并识别待测分子的颜色信号、记录信号强弱以检测所述待测抗体的含量的绿色激光。经过大量试验和深入的研究，对结核抗体的蛋白悬浮芯片制备及其检测条件作了实质性的改进和创新，其具有下列优点：1、抗原包被量的改进结核分枝杆菌的16KD和38KD蛋白抗原的包被量是成功检测的关键，本技术对包被微球的抗原包被量进行实质性优化使血清样本的 检测效果非常良好，并且包被悬浮芯片所需的抗原包被量很低，本技术的抗原包被量为0.01～90μg/1.25×106个编码微球，即0.002～360ng/2500～5000个微球/测试，而传统免疫学ELISA方法的包被量为4μg/测试。2、生物素标记的改进通常，标记抗体需要使用过量的生物素。理论上讲，在检测过程中，过量的生物素因未标记上抗体而不被微球上结合捕获抗体的抗体连接，清洗时被抽滤掉，不会与随后加入的SA-PE反应，不影响检测。但在实际检测过程中，偶尔遇到过检测信号可能过高的现象，出现假阳性，因此建议生物素标记抗体后，尽量去除多余的生物素。以标记2mg/mL的IgG(分子量150,000)1mL溶液为例，需加入10mM生物素溶液约27μL。3、方法的特异性本技术通过选用结核分枝杆菌的16KD和38KD蛋白为包被抗原，以兔抗结核抗体为待测抗体，以生物素化的羊抗兔为检测抗体。本研究试验证明，在存在鼠抗流感NP IgG、兔抗禽流感H5N1血清、兔抗鼠疫菌F1抗原多克隆抗体、兔抗SARS IgG干扰抗体存在条件下，本方法具有良好的特异性。4、样品的检测能力本技术评价了悬浮芯片方法对人血清的检测能力。通过对人血清的检测，初步证实了该方法在检测人血清中结核抗体的实用性。附图说明：图1为本技术结构示意图；图2为027号微球包被TB16KD和38KD蛋白检测结核抗体示意图；图3为蛋白悬浮芯片方法检测兔抗结核抗体剂量-反应标准曲线图；-->图4为ELISA方法检测结核病人血清标准曲线图；图5为蛋白悬浮芯片与ELISA方法检测结核病人血清的相关性。具体实施方式如图1至图5所示，本技术一种检测血清样本中结核抗体的蛋白悬浮芯片系统，包括芯片基体1、加液系统2、悬浮芯片检测仪3和计算机4，其中，芯片基体1为96孔滤板或者微量离心管，其内装有相关缓冲溶液和待测抗体，相关缓冲液中设置有编码微球(图中未示)，编码微球上包被有TB16KD和38KD蛋白，用于捕获待检测血清样品中的 待测抗体，如果样品中有结核抗体，结核抗体与编码微球上的TB16KD和38KD蛋白结合，再加入带有生物素标记的二抗，形成编码微球-TB16KD和38KD蛋白-结核抗体-二抗-生物素复合物，最后加入链亲和素-藻红蛋白，链亲和素与生物素结合，形成编码微球-TB16KD和38KD蛋白-结核抗体-二抗-生物素-链亲和素-藻红蛋白复合物，通过悬浮芯片检测仪对藻红蛋白荧光信号的检测来达到对血清样品中结核抗体的检测，如果血清样品中没有结核抗体，包被有TB16KD和38KD蛋白的编码微球不会与后面加入的生物素标记的二抗、链亲和素-藻红蛋白结合，最后通过悬浮芯片检测仪器进行检测时无荧光信号或应该信号非常弱。上述芯片系统中，编码微球在微球稀释液，待测抗体在样品稀释液中，生物素标记的二抗在抗体稀释液中，荧光信号检测物在SA-PE稀释液中，悬浮芯片检测仪检测时编码微球复合物在检测缓冲液中，每步结合之后均用微球清洗液洗涤微球，使得没有结合的物质清除体系。悬浮芯片的基本原理是利用聚苯乙烯(polystyrene)所制作的微球，包覆不同比例的红光及红外光发色剂，而产生100种不同比例颜色，作为100种独特本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种检测血清中结核抗体的蛋白悬浮芯片系统，其特征在于，该芯片系统包括：芯片基体、加液系统、悬浮芯片检测仪和计算机，其中，芯片基体内装有相关缓冲溶液和待测抗体，相关缓冲液中设置有０２７号编码微球，编码微球上包被有捕获抗原，悬浮芯片检测仪包括微细管检测通道和检测激光，计算机与悬浮芯片检测仪相连，并记录、分析悬浮芯片检测仪的测量结果。

【技术特征摘要】
1.一种检测血清中结核抗体的蛋白悬浮芯片系统，其特征在于，该芯片系统包括：芯片基体、加液系统、悬浮芯片检测仪和计算机，其中，芯片基体内装有相关缓冲溶液和待测抗体，相关缓冲液中设置有027号编码微球，编码微球上包被有捕获抗原，悬浮芯片检测仪包括微细管检测通道和检测激光，计算机与悬浮芯片检测仪相连，并记录、分析悬浮芯片检测仪的测量结果。2.如权利要求1所述的蛋白悬浮芯片系统，其特征在于，所述相关缓冲溶液包括用于所述待测抗体稀释的样品稀释液、稀释所述编码微球所用的微球稀释液、稀释所述生物素标记的二抗所用的抗体稀释液、每个反应之后洗涤编码微球所用的微球清洗液、SA-PE稀释液、检测缓冲液。3.如权利要求2所述的蛋白悬浮芯片系统，其特征在于，所述捕获抗原优选为...

【专利技术属性】
技术研发人员：王静，杨永莉，杨宇，张志华，史玲莉，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：实用新型
国别省市：11