本发明专利技术公开了一种根癌农杆菌介导的甘蔗遗传转化方法，包括将携带有植物表达载体的农杆菌液侵染甘蔗的胚性愈伤组织，通过筛选和增殖抗性愈伤组织，并诱导抗性愈伤组织获得甘蔗抗性芽，其中，所述的植物表达载体的基因表达盒两侧连有核质结合区序列。本发明专利技术将MARs序列构建到植物表达载体表达盒的两侧，其大大提高了甘蔗外源基因转化效率和成苗率，而且工艺流程简单，成本低。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物转基因
，具体涉及。
技术介绍
甘蔗是主要的糖料作物，高产、高糖、高抗和高经济效益是栽培甘蔗的最终目的， 也是甘蔗育种的主要目标。但是甘蔗的主要经济性状(如蔗茎产量、蔗糖份及生长特性等) 和抗逆性多属于数量性状，受微效多基因控制，受环境影响大，连锁群多，因此通过常规杂交育种要想把亲本所具有的全部优良性状综合起来非常困难。尤其是很难在甘蔗优良品种中有针对性地引入抗性基因。现代栽培甘蔗是多个种间复合杂合后代，为高度异源多倍体 (染色体数目高达2η = 36 170)，开花困难，常规杂交育种难度大，周期长(甘蔗传统育种从有性杂交到良种育成约需10 13年的选择过程)，而且新育成的高产优质品系还可能因为某一性状的缺陷，如抗病性差而难以推广应用。基因工程可以定向改变甘蔗的某些性状，特别是在甘蔗抗旱、抗寒、抗病虫等抗性育种及高光合、高糖等遗传性状改良方面。因此，通过转基因技术提高甘蔗抗性及糖份将是高产、高糖、高抗甘蔗育种的重要新途径。由于甘蔗复杂的多倍体基因组，与其他作物相比，在甘蔗转基因研究应用方面进展较小。甘蔗的遗传转化研究首次报道始于1987年，目前成功培育出转基因甘蔗的转化方法有原生质体电穿孔法、基因枪法和农杆菌介导法等3种，用于甘蔗转化的受体主要有胚性愈伤组织，茎尖分生组织，悬浮细胞及原生质体。尽管原生质体是遗传转化过程中外源 DNA的理想受体，可以获得外源基因整合及稳定表达的愈伤组织细胞，但甘蔗原生质体难以再生出甘蔗植株且只是局限在个别基因型上，因此这种转化方法并不是获得转基因甘蔗植株的有效方法。选用幼龄的具有高频再生能力的靶组织与细胞可缩短培养过程，防止体细胞变异，外植体大小均一，体积小有利于转化。目前大多数基因工程甘蔗的培育都是采用基因枪法。基因枪法是以完整细胞和组织为受体，将外源DNA溶液同钨、金等金属颗粒共同保温，使DNA吸附于金属颗粒表面，然后在真空条件下加速金属颗粒轰击细胞或组织，使之直接导入受体细胞或组织，经筛选后存活下来，表达导入的基因。该法操作简便、无基因型专一性，且可同时用几个质粒。1998年Arencibia等采用工程菌LBA4404和ΕΗΑ101，成功进行了农杆菌介导的甘蔗遗传转化，平均转化效率0. 194% 1. 115%。同年，Elliott使用工程菌株AGLO，转化效率为5. 13%。此后国内外都相继开展了农杆菌介导的甘蔗遗传转化研究。目前转基因甘蔗存在转化率低、基因表达量低或沉默、遗传稳定性差等问题，就其原因在于一是基因枪法转化的外源基因由于多拷贝插入，随机整合等使得转基因在甘蔗中的沉默现象很严重；基因枪法转化嵌合体比例大，转基因拷贝数多，遗传稳定性较差；二是影响根癌农杆菌转化甘蔗的因素，具体涉及甘蔗基因型、高效植物表达载体的构建(包括启动子和选择标记、MAR序列等)、受体材料类型及预处理、合适的农杆菌株系、菌体浓度、Vir 基因活化、浸染时间、共培养时间以及农杆菌的有效去除等。农杆菌介导的甘蔗转化技术， 由于其设备要求简单、费用低，且通常只会整合单个或少数拷贝的外源基因，因而，很少会有甲基化和基因沉默现象(Silencing)发生。由于甘蔗遗传背景的异源多倍性和高度杂合性，建立高效、可重复地稳定表达外源基因的农杆菌介导的甘蔗遗传转化技术仍是目前最关键的技术。此外，转基因在受体染色体上的整合是随机的，转基因的遗传稳定性及其表达活性在不同的转化体中存在很大差异，如果没有大量的转基因植株供筛选，就不可能获得遗传稳定、转基因性状良好、其他原有农艺性状未受破坏的转基因品种或株系。针对目前转基因甘蔗外源基因表达量过低和基因沉默等问题，各种高效表达启动子和表达载体的专利技术与利用是解决这个问题的有效方法。其中核基质结合区(Matrix attachment regions, MARs)的应用受到了广泛的关注。MARs是一种很好的基因表达调控元件，利用MARs是克服外源基因失活的一个有效方法。通过在目标基因两端添加核基质结合序列MAR形成LB-MAR-选择标记基因-目标基因-MAR-RB，LB-选择标记基因-MAR-目标基因-MAR-RB表达结构，在插入转基因植物染色体后形成独立的环状结构，具有稳定和提高基因表达水平，部分缓解由于位置效应以及甲基化引起的转基因沉默。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供。本专利技术提供的根癌农杆菌介导的甘蔗遗传转化方法，包括将携带有植物表达载体的农杆菌液侵染甘蔗的胚性愈伤组织，通过筛选和增殖抗性愈伤组织，并诱导抗性愈伤组织获得甘蔗抗性芽，其中，所述的植物表达载体的基因表达盒两侧连有核质结合区序列。其中，所述的农杆菌菌株可为本领域公知的用于植物转化的任何菌株，优选为 EHA105 或 LBA4404。其中，所述的甘蔗胚性愈伤组织为叶片诱导的I型胚性愈伤组织连续继代培养 1 5代获得的II型胚性愈伤组织，优选为培养2 3代的II型胚性愈伤组织，所述的II 型胚性愈伤组织为富有光泽、颜色淡黄、分散性好且疏松的胚性愈伤组织。其中，所述的叶片诱导的I型胚性愈伤组织按如下方式获得取顶端生长点5 IOcm的甘蔗幼嫩叶片作为外植体，将其横切成0. 1 0. 2cm 厚的薄片接种于胚性愈伤组织诱导培养基上，26°C 暗培养20 40天至叶片上长满白色致密的I型胚性愈伤组织组织，其中所述的诱导培养基是以MS为基本培养基，并添加 2 3mg/L 的 2，4-D。 根据本专利技术，所述的胚性愈伤组织继代培养为沈V 28 V暗培养，20 30天继代 1次，继代培养基是以MS为基本培养基，并添加0. 5 lmg/L的2，4-D。根据本专利技术，所述的筛选和增殖抗性愈伤组织为将侵染后的胚性愈伤组织转接到愈伤组织筛选增殖培养基中，26°C 暗培养，20 25天后选取再生的淡黄色、分散性好的愈伤组织进行继代，连续继代1 5代，优选继代2 3代，其中，所述的愈伤组织筛选增殖培养基是以MS为基本培养基，并添加lmg/L的2，4-D和50mg/L的潮霉素(Hyg)和 300 500mg/L的羧苄青霉素(Carb)。根据本专利技术，将获得的抗性愈伤组织接种至愈伤组织继代培养基进行恢复培养 3 5天，再转接至抗性芽分化培养基，^rc 光照培养，诱导丛生芽，其中所述的抗性芽分化培养基是以MS为基本培养基，并添加1. 0 2. Omg/L的6_BA、0. 05 0. lmg/L的 NAA、50mg/L的潮霉素(Hyg)和300 500mg/L的羧苄青霉素(Carb)。根据本专利技术，本专利技术提供的根癌农杆菌介导的甘蔗遗传转化还包括将1 2cm的丛生芽剥离成2-3株芽/丛，移至壮苗培养基进行壮苗培养2 3周，^TC 光照培养，待抗性苗长至3 km时，转入生根培养基诱导生根，26°C 光照培养，其中，所述的壮苗培养基是以MS为基本培养基，并添加0. 5 1. Omg/L的6_BA、0. 01 0. 05mg/L的 NAA、30mg/L的潮霉素和100 300mg/L的羧苄青霉素(Carb)，所述抗性苗生根培养基是以 MS为基本培养基，其中大量元素减半，并添加1. 0 4. 0mg/LNAA、30mg/L的潮霉素(Hyg)和 100 200mg/L的羧苄青霉素。本专利技术所述的培养基未有特殊说本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种根癌农杆菌介导的甘蔗高效遗传转化方法，其特征在于，包括将携带有植物表达载体的农杆菌液侵染甘蔗的胚性愈伤组织，通过筛选和增殖抗性愈伤组织，并诱导抗性愈伤组织获得甘蔗抗性芽，其中，所述的植物表达载体的基因表达盒两侧连有核质结合区序列。
【技术特征摘要】
1.一种根癌农杆菌介导的甘蔗高效遗传转化方法，其特征在于，包括将携带有植物表达载体的农杆菌液侵染甘蔗的胚性愈伤组织，通过筛选和增殖抗性愈伤组织，并诱导抗性愈伤组织获得甘蔗抗性芽，其中，所述的植物表达载体的基因表达盒两侧连有核质结合区序列。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的甘蔗胚性愈伤组织为叶片诱导的I 型胚性愈伤组织连续继代培养1 5代获得的II型胚性愈伤组织。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的甘蔗胚性愈伤组织为叶片诱导的I 型愈伤组织连续继代培养2 3代获得的II型胚性愈伤组织。4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述的叶片诱导的I型胚性愈伤组织按如下方式获得取顶端生长点5 IOcm的甘蔗幼嫩叶片作为外植体，将其横切成0. 1 0. 2cm厚的薄片接种于胚性愈伤组织诱导培养基上，26°C 暗培养20-40天至叶片上长满白色致密的I型胚性愈伤组织，其中所述的诱导培养基是以MS为基本培养基，并添加2 ;3mg/L的 2 A-O05.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述的继代培养为^TC 暗培养，20 30天继代1次，继代培养基是以MS为基本培养基，并添加0. 5 lmg/L的2，4-D。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的筛选和增殖抗性愈伤组织为将侵染后的胚性愈伤组织转接到愈伤组织筛选增殖培养基中，26°C 暗培养...
【专利技术属性】
技术研发人员：邓智年，魏源文，李楠，胡春锦，郭文峰，李杨瑞，
申请(专利权)人：广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室，
类型：发明
国别省市：45
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