本发明专利技术提供的用FQ-PCR检测嗜水气单胞菌的方法，应用FQ-PCR方法和针对仅存于有毒力的嗜水气单胞菌中的因子的上下游引物对模板中是否存在有毒力的嗜水气单胞菌进行检测，所用上下游引物及TaqMan探针是针对溶血素基因（hlyA）或丝氨酸蛋白酶基因（ahpA）的。与现有技术相比，由于所针对的因子是有毒力的嗜水气单胞菌株所特有的，因此可准确地检定试样中是否存在有毒力的嗜水气单胞菌株，从而提高疾病预警的准确性。同时，通过所说方法一或方法二检测出模板中含有溶血素基因（hlyA）或丝氨酸蛋白酶基因（ahpA），则表明其含有一定致病性，而通过方法三检测出模板中含有溶血素基因（hlyA）和丝氨酸蛋白酶基因（ahpA），则表明其含有较高致病性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及的是一种用FQ-PCR检测嗜水气单胞菌的方法，属化学中包含酶或微生物的测定或检验方法。
技术介绍
嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)在自然界中分布广泛,普遍存在于淡水、污水、淤泥、土壤和人类粪便中，可致各类动物感染，而人在感染嗜水气单胞菌时会发生食物中毒、腹泻等症状，并且是免疫抑制患者和肝功能疾病患者的机会致病菌，是一种典型的人、兽、鱼共患病病原菌。嗜水气单胞菌除了对水产养殖业带来巨大经济损失外，其对公共卫生，尤其是在临床疾病和食品安全方面的影响也非常严重。传统的嗜水气单胞菌的检测方法是生理生化鉴定和免疫学诊断，但由于该菌的许多生化特征不稳定，血清型也较复杂，故易产生误判。因此已有多项嗜水气单胞菌的PCR检测方法方面的报道，如中国专利技术专利申请“水产动物及人类病原菌——嗜水气单胞菌基因诊断试剂盒及检测方法(公开号CN1560275) ”、中国专利技术专利申请“水生实验动物剑尾鱼病原菌嗜水气单胞菌PCR检测试剂盒及检测方法(公开号CN1978665) ”、中国专利技术专利申请“嗜水气单胞菌的PCR检测试剂盒及其检测方法(公开号CN1506468) ”、中国专利技术专利申请“一种气单胞菌和嗜水气单胞菌双重PCR快速检测试剂盒和检测方法(公开号CN101736073A) ”和中国专利技术专利申请“致病性嗜水气单胞菌检测用试剂及其检测方法(公开号CN101418335) ”等，但上述所有关于嗜水气单胞菌的PCR检测方法都是普通的PCR检测，而且都为定性测定而不能定量测定。又有采用PQ-PCR检测嗜水气单胞菌方法的相关报道，如“嗜水气单胞菌TaqMan实时PCR检测方法的建立” (王海波等，《中华预防医学杂志》，43(7)，611-614)所公开的。针对细菌的种特异性基因采用PCR技术进行快速检测是近年来病原菌检测的热点，与常规PCR相比，实时荧光定量PCR检测技术具有特异性更强、敏感度更高、操作简便快捷、可定性定量、且可有效解决常规PCR污染问题等优点。但该公开技术中的引物设计的对象为嗜水气单胞菌的气溶素基因(aerolysin)和粘附素基因(adhesins)。大量研究表明，嗜水气单胞菌有致病菌株和非致病菌株之分，尽管嗜水气单胞菌及其胞外产物具有多种毒力因子，包括:粘附素(adhesins)、侵袭素(invasions)、肠毒素(enterotoxins)、溶血素(hlyA)、气溶素(aerolysin)、外膜蛋白(outermembraneproteins)、丝氨酸蛋白酶基因(ahpA)等，这些毒力因子在细菌的致病过程中起重要作用，不过这些毒力因子在对机体致病作用的发挥上是相互协同的，有些毒力因子的存在并不一定会致病而需要多种毒力因子的协同才会致病，而有些毒力因子只要存在便肯定是致病的。其中溶血素基因(hlyA)和丝氨酸蛋白酶基因(ahpA)就是只有致病的嗜水气单胞菌菌株所具备的，即嗜水气单胞菌无毒力菌株一般没有溶血素基因(hlyA)和丝氨酸蛋白酶基因(ahpA)，因此测定溶血素基因(hlyA)和丝氨酸蛋白酶基因(ahpA)对辨别有毒力的嗜水气单胞菌从而在应急预警和突发疾病处理方面具有更大的应用价值。
技术实现思路
针对上述不足，本专利技术所要解决的技术问题是提出一种针对仅存于有毒力菌株的DNA的用FQ-PCR检测嗜水气单胞菌的方法。本专利技术提供的用FQ-PCR检测嗜水气单胞菌的方法之一，先制备嗜水气单胞菌模板DNA，再进行扩增反应，即将准备好的扩增反应液加入模板DNA中，然后在PCR仪上进行扩增反应并获得数据供计算机进行计算，最后判断结果，所说扩增反应液中包括针对仅存于有毒力的嗜水气单胞菌菌株中的因子的上、下游引物，其中上游引物的DNA序列为5’ -ACCGCA AGA TCA ACG ATA CCG AGT-3’，下游引物的 DNA 序列为 5’-ATC CAG CGA GAT CCG CACTAT CTT-3’。所说扩增反应液中还包括TaqMan探针，该TaqMan探针的DNA序列为5’本专利技术提供的用FQ-PCR检测嗜水气单胞菌的方法之二，先制备嗜水气单胞菌模板DNA，再进行扩增反应，即 将准备好的扩增反应液加入模板DNA中，然后在PCR仪上进行扩增反应并获得数据供计算机进行计算，最后判断结果，所说扩增反应液中包括针对仅存于有毒力的嗜水气单胞菌菌株中的因子的上、下游引物，其中上游引物的DNA序列为5’ -ACCCAG GAC GGT GCG ATA TAA GAT-3’，下游引物的 DNA 序列为 5’_TCT CAC TTG CCT GAA CTGAAG CGA-3，。所说扩增反应液中还包括TaqMan探针，该TaqMan探针的DNA序列为5’本专利技术提供的用FQ-PCR检测嗜水气单胞菌的方法之三，先制备嗜水气单胞菌模板DNA，再进行扩增反应，即将准备好的扩增反应液加入模板DNA中，然后在PCR仪上进行扩增反应并获得数据供计算机进行计算，最后判断结果，整个步骤以平行的两组实验同时进行，其中之一所说扩增反应液中包括DNA序列为5’-ACC GCA AGA TCA ACG ATA CCG AGT-3’的上游引物，DNA序列为5’ -ATC CAG CGA GAT CCG CAC TAT CTT-3’的下游引物，DNA序列为 5’ -(FAM) -AAC ATC TCG CTG GTT TAC CGG GTC AA-(TAMRA)-3’ 的 TaqMan 探针；其中之二所说扩增反应液中包括DNA序列为5’ -ACC CAG GAC GGT GCG ATA TAA GAT-3’的上游引物，DNA序列为5’ -TCT CAC TTG CCT GAA CTG AAG CGA-3’的下游引物，DNA序列为5’本专利技术提供的用FQ-PCR检测嗜水气单胞菌的方法，应用FQ-PCR方法和针对仅存于有毒力的嗜水气单胞菌中的因子的上下游引物对模板中是否存在有毒力的嗜水气单胞菌进行检测，与现有技术相比，由于所针对的因子是有毒力的嗜水气单胞菌株所特有的，因此可准确地检定试样中是否存在有毒力的嗜水气单胞菌株，从而提高疾病预警的准确性。同时，通过所说方法一或方法二检测出模板中含有溶血素基因(hlyA)或丝氨酸蛋白酶基因(ahpA)，则表明其含有一定致病性，而通过方法三检测出模板中含有溶血素基因(hlyA)和丝氨酸蛋白酶基因(ahpA)，则表明其含有较高致病性。方法之三实质上是用方法一和方法二对同一个样品进行检测，当目标菌株同时具有2种毒力基因时可以判定其为强毒株嗜水气单胞菌；仅具有2种毒力基因之一时可以判定其为弱毒株嗜水气单胞菌；2种毒力基因均未检出时可以判定其为非致病性株嗜水气单胞菌。本专利技术提供的用FQ-PCR检测嗜水气单胞菌的方法，应用了以下试剂盒:该试剂盒，试剂盒所装试剂中有:①2x Premix EX Taq 反应液:由 Taq 酶、buffer、dNTP Mixture、Mg2+混合而成；②上游引物；③下游引物；④TaqMan 探针。所说试剂盒中下述试剂的包装量为其一次实验量的相同倍数:2x Premix EX Taq 反应液一次实验量为 10 μ I ;上、下游引物的浓度为5 μ Μ，一次实验量为0.本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种用ＦＱ－ＰＣＲ检测嗜水气单胞菌的方法，先制备嗜水气单胞菌模板ＤＮＡ，再进行扩增反应，即将准备好的扩增反应液加入模板ＤＮＡ中，然后在ＰＣＲ仪上进行扩增反应并获得数据供计算机进行计算，最后判断结果，其特征是所说扩增反应液中包括针对仅存于有毒力的嗜水气单胞菌菌株中的因子的上、下游引物，其中上游引物的ＤＮＡ序列为５’－ＡＣＣ ＧＣＡ ＡＧＡ ＴＣＡ ＡＣＧ ＡＴＡ ＣＣＧ ＡＧＴ－３’，下游引物的ＤＮＡ序列为５’－ＡＴＣ ＣＡＧ ＣＧＡ ＧＡＴ ＣＣＧ ＣＡＣ ＴＡＴ ＣＴＴ－３’。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王志铮，顾松叶，杨阳，王忠发，赵蓓蓓，
申请(专利权)人：浙江海洋学院，舟山市疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：33
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