一种获得栽培菊花单倍体的方法技术

本发明专利技术属于生物技术育种领域，公开了一种获得栽培菊花单倍体的方法。本发明专利技术选择栽培菊花品种为“母本”，利用蒙导父本的灭活花粉进行授粉杂交，并采用组织培养手段进行胚珠的离体培养，以克服菊属栽培菊花单倍体的生产和鉴定障碍。对获得的单倍体材料进行形态学鉴定和细胞学鉴定，选择茎、叶、花序、气孔等形态学特征与“母本”不同或出现特异性状单倍体材料，进行细胞学鉴定，若染色体组成为“母本”数目的一半，即为获得的单倍体。应用本方法成功地生产了多个栽培种的单倍体，为菊属植物种质创新和起源进化研究提供了新的材料。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物技术育种领域，涉及。
技术介绍
菊花(Chrysanthemum morifolium)为菊科菊属植物，栽培品种多为六倍体及其非 整倍体，是我国十大传统名花和世界四大切花之一，具有观赏、食用和药用价值(李鸿渐， 1993)，距今已有1600多年的栽培历史，由毛华菊、野菊和紫花野菊等天然杂交并经人工长 期选育而成(Chen，1957 ;Chen，1985)。菊花育种一直被认为是世界花卉育种史上的一个奇 迹，据统计，目前全世界菊花品种总数约为20000-30000个，我国传统菊品种超过4000个 (陈俊愉，2001)，是世界上商品产值最高的花卉(B0aes，1997)。菊花不仅在切花和盆花中 具有十分重要的地位，而且在露地栽培中也起到了越来越大的作用，因此加强菊花育种具 有很高的经济效益和社会效益。菊花是天然异花授粉植物，在自然界常有种间杂交现象发生，人工杂交也能获得 种间杂交植株。近年来，国内外研究者在菊花育种方法上，采用了自然杂交、人工杂交、芽变 选种、辐射诱变、组织培养、卫星搭载太空诱变、转基因、单细胞培养突变育种等方法。国内 外研究文献表明，目前绝大部分菊花品种都是经人工杂交育成，杂交是研究菊花及其它园 林植物起源和进化的重要途径，也是创造园林植物新类型和获得有价值的新品种的有效方 法(孟金陵，1997)。但是，由于对菊花亲本的遗传背景不清楚，不能够准确的预测菊花杂交 后代的性状，因此杂交育种的工作存在着很大的盲目性，不能按照确定的育种目标来准确 的选择杂交亲本。目前，杂交育种仍是菊花育种的主要方法，杂交育种的关键是获得优良的 纯系，但是由于菊花自交不育，不能通过自交等方法获得基因型纯合体，因此如何获得稳定 的纯系是我们目前迫切需要解决的问题。单倍体是大多数低等植物生命的主要阶段，在高等植物中出现的单倍体，几乎都 是由于生殖过程的不正常而产生的，大多数是孤雌生殖和孤雄生殖的结果。单倍体植物虽 然高度不育，通常生长衰弱，它本身没有多大价值，但是通过自然加倍或用人工方法使单倍 体植物的染色体加倍，即可获得完全纯合的二倍体，就和经过了好几代自交而产生的纯合 二倍体一样。育种者根据这个原理生产单倍体不仅能极早稳定分离后代，缩短育种年限，这 对自交不育或纯系获得较难的植物来说具有十分重要的意义。同时，单倍体培养不仅能够 获得一定的变异，还可以与常规育种、分子育种和转基因技术相结合，对各种复杂的遗传规 律进行分析，研究菊花的起源进化问题。这将对栽培菊花品种改良及优良新品种选育具有 深远意义也具有巨大的潜在商业价值。花药和花粉培养等孤雄生殖方式是获得单倍体的主要手段。近30年来利用花药 培养产生单倍体植株的技术已经应用到28个科68个属170多种植物上(卫志明，1999)。 花药培养存在得主要问题是植株不仅来自花粉，也来自花药的药壁药隔等其他部分，结果 得到的是不同倍性水平的混杂群体，因为单倍体产生的频率极低，所以需要花费大量的时 间进行鉴定，而且结果有待商榷，而使用花粉人工培养就可以克服这个困难。花粉培养中，花粉发育时期的重要性已有广泛的论述。因花粉发育时期是诱导小孢子分裂的关键。一般 来说，培养处于单核期的小孢子效果较好。但是菊花的花序为头状花序，花药为聚药雄蕊， 无法确定其具体生长时期，即使确定了其合适的生长时期，将花药取出也极其困难，加之菊 花的花粉活力低下，经灭菌后几无活力，使得花药培养十分困难。未受精的胚珠培养属于孤雌生殖，也是获得单倍体的重要手段，与花药和花粉培 养相比，胚珠培养获得的后代产生单倍体比例更好，鉴定更方便，但是胚珠培养一般不易产 生后代。因此未受精的胚珠培养技术亟待重视和加强。如果此技术成熟，将是我国菊花育 种(尤其是杂交育种和起源进化研究上)取得重要突破的关键所在。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的上述不足，提供。本专利技术的目的可通过如下技术方案实现，包括如下步骤(1)选择菊属栽培菊花或其近缘属植物为蒙导父 本，以栽培菊花为“母本”，利用蒙导父本的灭活花粉进行杂交授粉，取杂交授粉后13d的头 状花序，剥取边缘舌状花的子房进行消毒处理；(2)将步骤⑴所述的经消毒的子房内的胚珠剥出，接入MS添加细胞分裂素 6-BA2. 5mg · Γ1+生长素ΝΑΑ0. 5mg · Γ1的培养基上，诱导愈伤组织形成；(3)愈伤组织形成30d 40d后转入分化培养基，分化培养基为MS+细胞分裂素 6-BA2. Omg · L—1+生长素NAAO. Img · L—1，诱导愈伤组织分化出苗；(4)经步骤(3)得到幼苗后将幼苗转入MS+细胞分裂素6-BAO. 2mg -L"1的培养基中 进行扩繁和继代培养。当幼苗长至2 3cm时，将其移至1/2MS添加生长素NAAO. Img · L—1 的培养基上生根，培养温度为25士2°C，光照周期为14h · cT1，光照强度为1500 20001x， 即可获得栽培菊花单倍体材料的无菌苗；(5)对所得材料进行形态学鉴定，选择形态学特征在株高、冠径、分枝性、叶片、花 序等方面与“母本”不同的植株，再进行细胞学鉴定。经细胞学鉴定体细胞染色体数目是“母 本”体细胞染色体数目一半的后代材料，即为所述的栽培菊花单倍体。所述的“母本”选自钟山金桂或钟山紫桂，优选钟山紫桂。所述的蒙导父本选自茼蒿属白晶菊。所述的杂交授粉是收集所述的蒙导父本的花粉并以干热空气进行灭活，对所述的 “母本”进行人工去雄并套袋隔离，于温室内进行杂交，于上午9 10时或下午3 4时授 粉，同一花序重复授粉2次。所述的消毒处理是在超净工作台上依次开展以下操作用体积比为75%的乙醇 浸泡30s，质量百分比为0. 的升汞溶液消毒3min，无菌水冲洗5次。有益效果本专利技术利用菊属栽培种结合现代生物技术进行菊花单倍体育种研究，首 次通过使用蒙导父本的灭活花粉进行授粉杂交并结合胚珠培养的方法获得了栽培菊花单 倍体，克服了菊属单倍体获得的问题，拓宽了菊花育种的思路和领域，扩展了栽培菊花的遗 传基础，实现了菊花的种质创新。本专利技术结合利用形态学和细胞学对所得材料进行鉴定，结果真实可靠。在本专利技术基础上，使利用纯合体菊花进一步开展菊花育种成为可能，同时可利 用现代分子生物学等手段进行菊属的染色体组分析、起源演化及亲缘关系研究等，有重要 的理论意义和现实意义。附图说明图1、钟山紫桂与其单倍体形态学比较鉴定A-B 盛花期植株形态比较，A 钟山紫桂，标尺=5cm ；B 钟山紫桂其单倍体，标尺 =5 cm ；C 叶片形态比较，钟山紫桂(左)，钟山紫桂其单倍体(右)，标尺=0. 5cm ；D-E 叶背面气孔比较D 钟山紫桂叶背面气孔，标尺=100 μ m，E 钟山紫桂其单 倍体叶背面气孔，标尺=100 μ m。图2钟山紫桂与其单倍体细胞学比较鉴定，左图钟山紫桂的染色体有丝分裂中期形态(2η = 6χ = 54)，标尺=5μπι;右图 钟山紫桂其单倍体的染色体有丝分裂中期形态(In = 3χ = 27)，标尺=5μπι。具体实施例方式实施例1材料选择选择菊属栽培菊花‘钟山紫桂’(中国菊花研究网，http://www. chrysanthemum, cn)作为“母本”，以茼蒿属白晶菊为蒙导父 本。以上材料全部种本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种获得栽培菊花单倍体的方法，其特征在于包括如下步骤：（１）选择菊属栽培菊花或其近缘属植物为蒙导父本，以栽培菊花为“母本”，利用蒙导父本的灭活花粉进行杂交授粉，取杂交授粉后１３ｄ的头状花序，剥取边缘舌状花的子房进行消毒处理；（２）将步骤（１）所述的经消毒的子房内的胚珠剥出，接入ＭＳ添加细胞分裂素６－ＢＡ２．５ｍｇ·Ｌ－１＋生长素ＮＡＡ０．５ｍｇ·Ｌ－１的培养基上，诱导愈伤组织形成；（３）愈伤组织形成３０～４０ｄ后转入分化培养基，分化培养基为ＭＳ＋细胞分裂素６－ＢＡ２．０ｍｇ·Ｌ－１＋生长素ＮＡＡ０．１ｍｇ·Ｌ－１，诱导愈伤组织分化出苗；（４）经步骤（３）得到幼苗后将幼苗转入ＭＳ添加细胞分裂素６－ＢＡ０．２ｍｇ·Ｌ－１的培养基中进行扩繁和继代培养，当幼苗长至２～３ｃｍ时，将其移至１／２ＭＳ添加生长素ＮＡＡ０．１ｍｇ·Ｌ－１的培养基上生根，培养温度为２５±２℃，光照周期为１４ｈ·ｄ－１，光照强度为１５００～２０００ｌｘ，即可获得栽培菊花单倍体材料的无菌苗；（５）对所得材料进行形态学鉴定，选择形态学特征在株高、冠径、分枝性、叶片、花序方面与“母本”不同的植株，进行细胞学鉴定。经细胞学鉴定体细胞染色体数目是“母本”体细胞染色体数目一半的后代材料，即为所述的栽培菊花单倍体。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈发棣，王海滨，陈素梅，管志勇，房伟民，刘兆磊，李真，滕年军，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：84