一种采用磁性纳米粒子提取细菌基因组DNA的方法技术

一种采用磁性纳米粒子提取细菌基因组DNA的方法，属于纳米材料和分子生物学技术领域。本发明专利技术包括磁性纳米粒子聚集体的制备，细菌裂解液的配制，吸附缓冲液的配制及添加，磁铁吸附，用70%的乙醇漂洗，用TE缓冲液洗脱，获得细菌基因组DNA溶液。本发明专利技术利用合成的磁性纳米粒子提取细菌基因组DNA，相比传统的酚/氯仿DNA提取方法，整个实验耗时短，操作简单，提取效率高，具有快速、简便、灵敏、得率高等优点，提取的细菌基因组DNA完全可以用于DNA杂交和PCR等后续实验，为以后的研究分析提供了基础。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
１．一种采用磁性纳米粒子提取细菌基因组ＤＮＡ的方法，其特征在于包括磁性纳米粒子聚集体的制备，细菌裂解液的配制，吸附缓冲液的配制及添加，磁铁吸附，用７０％的乙醇漂洗，用ＴＥ缓冲液洗脱，获得细菌基因组ＤＮＡ溶液；（１）磁性纳米粒子聚集体的制备：①称取０．６５ｇ无水三氯化铁和０．４ｇ柠檬酸三钠，量取２０ｍＬ乙二醇，搅拌２０ｍｉｎ，使之全部溶解；②称取１．２ｇ无水乙酸钠加入到上述反应体系中，搅拌１０ｍｉｎ，置于四氟乙烯反应釜中油浴加热至２３０℃，同时进行磁力搅拌，反应１０ｈ后停止加热，继续磁力搅拌冷却至室温；③反应后的溶液加入２０ｍＬ的无水乙醇，超声清洗１０ｍｉｎ，５０００ｒｐｍ离心１０ｍｉｎ，弃上清；④下层沉淀加入２０ｍＬ无水乙醇，超声清洗１０ｍｉｎ，５０００ｒｐｍ离心１０ｍｉｎ，弃上清；⑤下层沉淀加入２０ｍＬ去离子水，超声清洗１０ｍｉｎ，５０００ｒｐｍ离心１０ｍｉｎ，弃上清；⑥下层沉淀悬浮于１０ｍＬ去离子水中，得磁性纳米粒子聚集体，室温保存备用；（２）细菌裂解液的配制：对于革兰氏阴性菌，取１ｍＬ细菌增菌液于２ｍＬ灭菌离心管，１００００ｒｐｍ离心５ｍｉｎ，倒掉上清液，将沉淀溶解于１ｍＬ细菌裂解液中，涡旋震荡１５ｓ混合均匀，７０℃水浴１０ｍｉｎ；所述细菌裂解液组成为：５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，１０ｍＭ　ＥＤＴＡ，１％　ＳＤＳ，５ｍｇ／ｍＬ蛋白酶Ｋ，ｐＨ８．０；或对于革兰氏阳性菌，取１ｍＬ细菌增菌液于２ｍＬ灭菌离心管，１００００ｒｐｍ离心５ｍｉｎ，倒掉上清液，将沉淀溶于５００μＬ缓冲液Ａ中，涡旋震荡１５ｓ混合均匀，３７℃水浴３０ｍｉｎ后，加入５００μＬ缓冲液Ｂ中，涡旋震荡１５ｓ混合均匀，７０℃水浴１０ｍｉｎ；所述缓冲液Ａ组成为：含５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、１．２％曲拉通、２０ｍｇ／ｍＬ溶菌酶，ｐＨ８．０；所述缓冲液Ｂ组成为：含１％　ＳＤＳ、５ｍｇ／ｍＬ蛋白酶Ｋ，ｐＨ８．０；（３）吸附缓冲液的配制及添加：配制吸附缓冲液１０％／６Ｍ的ＰＥＧ／ＮａＣｌ水溶液，其中聚乙二醇６０００质量浓度１０％、ＮａＣｌ浓度６Ｍ；在步骤（２）所得１ｍＬ细菌裂解液中加入制备好的磁性纳米粒子聚集体１０μＬ，再加入吸附缓冲液ＰＥＧ／ＮａＣｌ水溶液５００μＬ，使ＮａＣｌ终浓度控制为２Ｍ，上下颠倒数次，混合均匀，震荡反应１０ｍｉｎ，获得吸附细菌基因组ＤＮＡ的磁性纳米粒子；（４）磁铁吸附：用磁铁将吸附有细菌基因组ＤＮＡ的磁性纳米粒子与溶液分离，倒掉上清液；（５）用７０％的乙醇漂洗：用７０％乙醇漂洗液清洗吸附有细菌基因组ＤＮＡ的磁性纳米粒子两次，室温放置０．５ｈ，使残留乙醇挥发完全；（６）用ＴＥ缓冲液洗脱：加入５０μＬＴＥ缓冲液，混匀后６５℃水浴孵育１０ｍｉｎ，磁分离，取上清，即为细菌基因组ＤＮＡ溶液，保存于－２０℃，备用；所述ＴＥ缓冲液为：含１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０的混合溶液。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王利兵，胥传来，勇倩倩，邓小芳，屈昌龙，刘微波，赵书阁，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：32