斑马鱼B淋巴细胞刺激因子（zBAFF)cDNA及其克隆方法和重组应用，涉及生物基因工程领域。斑马鱼B淋巴细胞刺激因子基因的克隆方法如下：TRIzol法提取斑马鱼脾脏总RNA并进行逆转录；通过Clustalw软件分析虹鳟鱼,大西洋鲑鱼,斑点绿河豚BAFFcDNA以及虹鳟鱼，大西洋鲑鱼，斑点叉尾鮰BAFFcDNA保守区设计兼并引物进行PCR扩增，获得807bp全长cDNA。所述斑马鱼B淋巴细胞刺激因子和增殖诱导配体cDNA可通过现有基因工程方法，生产重组斑马鱼的BAFF。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物基因工程领域，具体涉及B淋巴细胞刺激因子cDNA及其克隆和重 组应用。
技术介绍
BAFF具有很强的B细胞趋化性，在体外作为B细胞增殖和分化的共刺激因子，能 诱导活化的B细胞分泌大量的IgG、IgA、IgM等。对于休眠B细胞，BAFF虽不能独立激活使 之进入细胞周期循环，但通过上调细胞表面的抗凋亡蛋白Bcl-2、BcI-Xl的表达，可延长休 眠B细胞的寿命。在体内，它可以促进脾脏内Tl-B细胞向T2-B细胞以及成熟B细胞的发 育。BAFF的正常表达是GC形成、抗体亲和力成熟、记忆性B细胞形成及B细胞正常发育的 必须条件BAFF+小鼠的次级淋巴器官囊外及过渡区B细胞完全缺失，而BAFF转基因小鼠则 由于B220+细胞数目剧增而引起脾脏、淋巴结、派尔斑(Peyer’ s patch)肿大，血清中IgM、 IgG、IgA、IgE滴度上升，8周后出现与典型SLE(系统性红斑狼疮)相似的症状。最近的研 究显示BAFF还具有调节B细胞分化的作用。BAFF在体外能促进B系淋巴瘤的增殖，并抑制 FasL-Fc和TACI-Fc的促凋亡作用，提示其还可能具有抑制细胞凋亡的作用。由于T细胞表面表达BAFF特异性受体BAFF-R，且用抗BAFF-R的单克隆抗体 能阻断BAFF对T细胞的增殖效应，因此推测BAFF通过BAFF-R对T细胞的激活和分化起共 调节作用。有专家认为，BAFF是B细胞存活的关键因子，犹如针对B细胞的一个精妙的安检 站。过度表达BAFF可以减少B细胞的耐受性，产生免疫反应。目前临床实验得到的结果证 明了 BAFF在类风湿性关节炎(RA)发病中的病理学角色。研究发现，存在于骨髓中的B细 胞的发育和选择不依赖于BAFFJfii B细胞离开骨髓，便成为外周B细胞存活和成熟以及 T、B细胞激活的主要细胞因子。BAFF不仅是B细胞的存活因子，还对T细胞激活有共刺激作用。最新研究表明， BAFF的表达水平与感染和炎症反应密切相关。T、B细胞在自身免疫疾病中起到了重要作用，而BAFF主要表达在单核细胞、巨 噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞和活化的T细胞表面，分泌细胞因子、生长因子和各种介 质，使B细胞活化为浆细胞，分泌大量免疫球蛋白，包括自身抗体，使机体出现炎性反应和 破坏。BAFF是B细胞活化的正调节蛋白。通过实验研究发现，与正常对照组比较，RA患 者的BAFF血清水平明显增高，B细胞活化的标记物可溶性⑶23 (s⑶23)同样有明显升高， 但二者相比无相关性。进一步研究发现，BAFF与RF具有相关性，表明BAFF在RA中作用是 诱导自身抗体的产生，而不是B细胞的活化。干燥综合征中BAFF及其受体在唾液腺局部表达的作用，进一步研究表明这些细 胞因子具有活性，可以延长正常B细胞的存活。在SS中，BAFF的表达不仅来源于上皮细胞 和T细胞，还来自于B细胞，通过自分泌发挥免疫作用各种研究表明，许多恶性B系肿瘤异常表达BAFF和APRIL，并且这些肿瘤细胞表面 表达一种或多种BAFF与APRIL受体。人们也研究了“诱饵受体”BCMA-Fc、TACI_Fc及BAFF 的单克隆抗体对这些B系肿瘤抑制的影响，发现这些抗体及抗体类似物均能恢复这些肿瘤 细胞的凋亡作用。BAFF/APRIL配体-受体系统极有可能成为对抗多种恶性肿瘤的分子靶点库。根据GenBank、EMBL和DDBJ国际三大主要核酸序列数据库搜索结果得知，目前已 知BAFF基因序列的鱼类包括虹鳟鱼，大西洋鲑鱼，斑点绿河豚；APRIL基因序列包括虹 鳟鱼，大西洋鲑鱼，斑点叉尾鮰，并分别已在GenBank数据库中申请了序列号，序列号分别 是 ABC84582、NP_001135232, SINFRUP00000153079、EF451543、DY736744、CB940845。斑马 鱼B淋巴细胞刺激因子(zBAFF) cDNA还未被克隆出来，关于斑马鱼BAFF基因的研究在整 个国内外还处于完全空白状态。斑马鱼(Zfeflio rerio)，又名蓝条鱼、花条鱼、斑马担尼鱼，属于辐鳍亚纲 (Actinopterygii)鲤科iPyprinidae)短担尼鱼属(JMnio)的一种硬骨鱼。原产自印度东 部、巴基斯坦、缅甸、孟加拉国等南亚地区，是一种常见的热带鱼。斑马鱼是国际标准化组织 认可的5种鱼类实验动物之一，已经成为发育生物学、遗传学、毒理学等研究常用的模式生 物。60年代末70年代初，Mreisinger首先对这种生物进行了单倍体培育，建立了第 一个用紫外线突变的突变体。随着纯合子培养技术的成熟和广泛高效的突变剂ENU的出 现，位于TUbingen和Boston等地的几个实验室自1993年开始对斑马鱼进行ENU大规模系 统突变筛选和建库工作。1994年，在冷泉港召开的斑马鱼研究专题会议，标志着斑马鱼已成 为继小鼠，果蝇，线虫后又一生物学研究的重要模式生物。虽然斑马鱼最初主要被用来进行遗传学及发育生物学研究，但近几年，随着 对斑马鱼了解的日趋深入，其在免疫学中的应用也越来越为人们所重视。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供一种从斑马鱼提取的B淋巴细胞刺激因子 cDNA，并提供斑马鱼B淋巴细胞刺激因子cDNA的克隆方法及重组应用。本专利技术从斑马鱼中克隆到B淋巴细胞刺激因子cDNA，它具有SEQ ID NO. 1所示的 序列。斑马鱼B淋巴细胞刺激因子，它具有SEQ ID NO. 2所示的序列。本专利技术的斑马鱼B淋巴细胞刺激因子cDNA的克隆方法如下(1)从斑马鱼脾脏组织总RNA(2)利用RT-PCR方法通过同源克隆(homologycloning)策略并结合cDNA末端快速扩 增法(RACE)克隆斑马鱼全长BAFF的cDNA序列。上述斑马鱼B淋巴细胞刺激因子cDNA的克隆方法具体操作如下(1)利用Trizol试剂一步法提取斑马鱼脾脏组织总RNA(2)通过Clustalw软件分析虹鳟鱼，大西洋鲑鱼，斑点绿河豚BAFF cDNA保守区， 设计兼并引物zBAFF1 5'-TTGTNCCNTGGCTTCTNAGCTTTAA-3' ； (SEQ ID N0. 3)zBAFF2 5' -GCACCAAANAANGTNNCNTCTCC-3' (SEQ ID NO. 4) (3)进行PCR扩增，得到807bp的片段，如SEQ ID NO. 1所示。通过CLUSTAL软件分析，比对斑马鱼与虹鳟鱼、大西洋鲑鱼、斑点绿河豚的BAFF氨 基酸序列(Genbank ABC84582, NP_001135232, EN: SINFRUP00000153079)结果如图 3所示， 它们的同源性分别为67. 6，61. 4和66. 9%，并且可溶部分比跨膜区和胞内区在进化上更保 守。其开放阅读框如SEQ ID NO. 1所示。上述斑马鱼B淋巴细胞刺激因子(zBAFF)的cDNA的重组应用，通过现有基因工程 方法，生产重组zBAFF。具有绿色荧光活性的重组蛋白，其可溶性、稳定性及生物学活性达到 了预期的良好效果，为进一步进行相关的研究提供了生物工程工具的前体。附图说明图1 zBAFF (GenBank NO. FJ587513)的cDNA序列及对应的蛋白序列图2保守氨基酸用黑色阴影标注，本文档来自技高网...
【技术保护点】
１． 斑马鱼Ｂ淋巴细胞刺激因子ｃＤＮＡ，其特征在于，具有ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１所示的序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张双全，闵翠，梁臻宁，
申请(专利权)人：南京师范大学，
类型：发明
国别省市：84
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